[发明专利]来源于胸苷酸合酶的、具有免疫学和抗肿瘤活性的多表位肽

说明书

发明领域

本发明涉及具有抗肿瘤活性的肽和其相关的药物组合物。特别地，本发明涉及具有抗肿瘤的预防性和治疗性活性的肽，也涉及所述肽与其他已知的抗肿瘤化合物例如5-氟尿嘧啶组合。

现有技术

胸苷酸合酶(TS)是能够响应其辅助因子和其底物的表达水平而调节其自身的细胞内蛋白。TS是真核细胞中胸腺嘧啶核苷的主要来源，从而是DNA合成和复制所必需的。

在还原叶酸存在的情况下，其通过向脱氧尿嘧啶核苷中加入单碳酸(monocarbonate)单位来合成胸腺嘧啶核苷[1，2]。

因此TS严格地参与DNA复制和细胞增殖，从而在正常细胞中，其表达受到参与细胞周期的基因的严格调控，且只在S期短暂表达[3，4]。

相反地，在肿瘤细胞中，TS组成型地表达且其表达的强度是增殖的指数。基于这些考虑，一些最有活性的抗肿瘤药物，包括抗代谢物，通过抑制该酶直接和/或间接地发挥作用[5]。

此外，TS是被5氟脱氧尿嘧啶核苷一磷酸(5-FdUMP)(5-氟尿嘧啶(5-FU)的代谢物)抑制的至关重要的酶靶，5-氟尿嘧啶是细胞毒性活性最强的药物中的一种且用于几乎所有的用于治疗胃肠器官的恶性肿瘤、乳腺癌和头与颈恶性肿瘤的综合化学疗法的治疗方案中[6]。

5-FU是必须在赘生性细胞的细胞质中被活化成两个细胞毒性代谢物：5-氟-尿嘧啶核苷三磷酸(5-FUTP)和5-FdUMP的氟代嘧啶前体药物。后者特别地负责TS的永久性抑制，所述TS和5-FdUMP也与还原的叶酸结合，其形成稳定的三元复合物(tertiary complex)，该复合物在细胞质中被负责形成来源于肿瘤抗原的肽表位的蛋白酶体系统快速降解。

如今许多研究已证明TS的组成型或获得型过度表达以及其突变是肿瘤细胞的有效逃逸机制，因为其提供了对5-FU的抗性[7]。

在这点上，许多研究已显示患有胃癌或结肠癌的患者中TS的高水平或其突变预示着对药物的抗性和被认为是负面的预后因素[8，9]。

即使是在组成型表达低或中等水平的TS的肿瘤细胞中，该酶，无论怎样，都接受有效的自我调节活性，因为在只有5小时的对5-FU的暴露后，这些细胞也都显示了适应性反应，产生了该酶的清晰和即刻的过度表达[10]。

因此存在对发展治疗工具的需要是很平常的，所述治疗工具可单独地或与其他化学治疗剂一起克服5-FU的不足，以完全消除肿瘤疾病，从而治疗患有恶性肿瘤特别是乳腺和胃肠器官的恶性肿瘤的患者。

发明概述

本发明的发明者已发展了称为TS/PP的具有免疫治疗活性的抗肿瘤肽试剂，该试剂也可与常规的基于氟代嘧啶的化学治疗法组合且能够在体内和体外获得能够破坏过度表达该TS酶的肿瘤细胞的多表位、细胞毒性T淋巴细胞反应。因为TS蛋白的表达是癌发生过程中在所有人肿瘤中发生的最早改变中的一个改变，因此本发明的肽除了其治疗活性外还具有预防性免疫保护作用。

TS/PP是合成的肽28聚体(amer)，其特征在于其包含表位性质的各种氨基酸序列，其中一些氨基酸序列潜在地能够结合I类HLA分子(包括三种已知的对于HLA-A(*)02.01是特异性的表位：TS-I、TS-2和TS-3)[11]和II类HLA分子的单倍型(haplotype)。已在人的体外模型中和在经基因工程改造而具有人的主要组织相容性系统的I类分子(单倍型HLA-A(*)02.01)的小鼠(转基因HHD小鼠)中证明了TS/PP的免疫学和抗肿瘤活性，所述小鼠表达与人TS非常相似(90-95％氨基酸相似性)的TS。

在人模型中，通过用低剂量的白细胞介素2周期性刺激人外周血单核细胞(PBMCs)(来源于正常供体和患有恶性肿瘤的供体)和与之前暴露于TS/PP的自体树突细胞共培养来将TS/PP用于体外产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)系。这些淋巴细胞系表现出明显的抗乳腺癌和结肠癌(HLA-A(*)02.01+)肿瘤细胞的细胞毒性活性。如果将肿瘤细胞预先暴露于能够增加TS内源表达的亚致死剂量的5-FU中，该细胞毒性活性显著增加。

在动物模型中，对用表达TS的自体(EL-4HHD)白血病细胞接种的HDD小鼠施用TS/PP具有有效的(预防性和治疗性的)抗肿瘤活性，该活性可通过与5-FU的组合治疗来增加。TS/PP的免疫原活性和抗肿瘤活性与任何不利事件或自生免疫无关，但在鼠类和人模型中，都远比通过单个或一起使用的已知的TS表位肽(TS-1、TS-2和TS-3)产生的活性高。