[发明专利]蘑菇的糖工程

说明书

本发明涉及遗传工程领域，更特别涉及糖蛋白生产领域，更特别涉及糖蛋白的糖基化模式的工程化。

糖蛋白是已经经历了所谓的翻译后修饰的蛋白质，即糖基团与蛋白质共价偶联。发现由活细胞产生的大约50％的蛋白质均经历糖基化。另外，看起来糖基化类型在真核细胞中不同，意味着使用不同类型的糖部分和/或所述部分以不同顺序与所述蛋白质主链附着，从而形成多种分支结构。蛋白质的糖基化在分化、发育过程中、在不同的生理及细胞培养条件下及在疾病中是高度调控和变化的。重组蛋白质、特别是意欲给予人体的重组蛋白质的糖基化是特别重要的，因为其影响该(糖)蛋白的许多性质，如正确的折叠、蛋白酶抗性/敏感性、细胞内运输和区室化、分子间亲和性和组织靶向。另外糖基化还明显影响生物学半衰期、活性、功能、可溶性、从循环中的清除以及对药物糖蛋白至关重要的抗原性。

非人物种的细胞不以与人细胞相同的方式使其蛋白质糖基化。在许多情况中，差异是显著的。大体上，与人在进化方面最远的物种如细菌、酵母、真菌、昆虫和植物一在表达系统中最常用的物种一具有丝毫不象我们所特有的糖基化全部组分(repertoire)。

由重组细胞表达系统或转基因生物分泌的单克隆抗体几乎总是含有在Asn 297的糖基化位点，这是位于所述分子Fc区域内的CH2结构域中的位点。缺少CH2结构域中的N联聚糖的单克隆抗体呈现由所述分子Fab部分的超可变区介导的正常抗原结合，但是缺乏Fc效应物功能，如抗体依赖性细胞胞毒性(ADCC)和补体介导的溶胞作用(CDL)。这些及其它效应物功能需要IgG分子的Fc结构域与蛋白质如免疫细胞表面上的Fc受体(ADCC)或者引发补体级联的可溶的蛋白质(CML)之间的分子识别。糖基化对于抗体效应物功能如ADCC和CML非常重要，其通过作为肿瘤消解药物(oncolytics)开发的抗体介导杀死肿瘤细胞。

目前有许多表达系统被用作或者被探索用作生物制药生产平台(大肠杆菌(E.coli)，CHO细胞，昆虫细胞，植物，藻类，酵母，丝状真菌等)。适宜性通过许多参数确定，例如安全性、效力、成本及同样重要的是否需要翻译后修饰。

酵母表达系统和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)特别用作N-糖基化特别需要的潜在生物制药生产平台。如上所述，这种翻译后修饰的实际组成对于某些涉及单克隆抗体的治疗方法、特别是需要患者免疫系统作用的那些是必需的，为此，需要在这种酵母的N-糖基化途径中建立基础变化。

仍需要一种低成本高产量的有效提供“人样”糖基化的系统。

发明概述

本发明人观察到一些担子菌没有过度甘露糖基化或复合N-聚糖，并且主要含有范围为Man9至Man5的高甘露糖N-聚糖。发现仅仅导入异源GnT-I活性而不对N-糖基化途径进行任何额外干扰即可在担子菌中合成杂合结构GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂(也称作GnM5)。这种杂合结构可进一步在体内或体外修饰，以获得具有哺乳动物类型N-糖基化模式的重组糖蛋白质。

附图描述

图1：群交裂褶菌(S.commune)野生型(A组)及用人GnT-I基因转化的转基因品系Sc2(B组)的子实体的N-聚糖的(M+Na)⁺加合物的MALDI-TOF质谱。箭头表示在m/z 1460.5的相应于GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂的离子。

图2：图1中示出的MALDI-TOF质谱的详细描述。群交裂褶菌野生型(A组)及用人GnT-I基因转化的转基因品系Sc2(B组)。箭头表示在m/z 1460.5的相应于GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂的离子。

图3：群交裂褶菌野生型(A组)及用人GnT-I基因转化的转基因品系Sc12(B组)的子实体的N-聚糖的(M+Na)⁺加合物的MALDI-TOF质谱。箭头表示在m/z 1460.5的相应于GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂的离子。

图4：图3中示出的MALDI-TOF质谱的详细描述。群交裂褶菌野生型(A组)及用人GnT-I基因转化的转基因品系Sc2(B组)。箭头表示在m/z 1460.5的相应于GlcNAc(Man)₅(GlcNAc)₂的离子。