[发明专利]核糖体展示方法或mRNA展示方法以及对蛋白质改进的稳定性进行的选择

说明书

本发明涉及选出、获得或制备稳定性改进的多肽变体的方法。本发明还涉及所述变体在选择后的制备和用途，例如在治疗中的用途。

本发明利用展示技术，结合体外翻译，以及在RNA之类的基因型和目标多肽之类的编码表型之间的共价连接或非共价连接(non-covalentlinkage)，来选出比亲本多肽稳定性改进且保持功能活性的多肽变体。

核糖体或多核糖体(polysome)展示和选择涉及构建核酸文库，筛选结合，鉴定出目标结合实体。通过合成多样化序列的DNA库，将该库转录产生mRNA库，制得所述文库。体外翻译用于产生需要展示的编码多肽或蛋白，所需的结合用固相靶抗原选出。编码所述结合实体的mRNA可用于制备cDNA并将该cDNA扩增，可以重复该过程，使编码结合物的基因数大增。随后，可以克隆各个编码序列并进行DNA测序，从而鉴定出所选蛋白。

所述技术已有多方面的综述(Hanes等，(2000)Meth.Enzymol.328，403-430；Plückthun等，(2000)Adv.Prot.Chem.55，367-403；Lipovsek和Plückthun(2004)J.Immunological Methods 290，51-67)。

该技术已用于展示抗体片段、肽和各种蛋白，包括周质蛋白和胞质蛋白，如β-内酰胺酶和锚蛋白-重复蛋白。

从多核糖体复合体中回收mRNA首先报道于1973年的论文中，该论文描述了利用抗体和固定的寡胸苷来捕获编码小鼠免疫球蛋白L链的mRNA的方案(Schechter(1973)PNAS USA 70，2256-2260)。Payvar和Schimke对多核糖体免疫沉定反应方案进行了改进(Eur.J.Biochem.(1979)101，271-282)，在利用单克隆抗体对多核糖体进行免疫沉淀后，获得了HLA-DR抗原的重链cDNA克隆(PNAS USA(1982)79，1844-1848)。Kawasaki提出并取得了利用核糖体展示来制备抗体文库的专利(美国专利号5,643,768和美国专利号5,658,754，EP-B-0494955)。

已有多个利用真核或原核翻译体系进行核糖体展示的应用实例。利用大肠杆菌提取物选择肽配体是由Mattheakis等首个论证的(PNAS USA(1994)91，9022-9026和Methods Enzymol(1996)267，195-207)。该小组利用给定抗体作为选择底物，证实选出了与给定抗体的已知肽表位很相似的肽配体。结合前列腺特异性抗原的高亲和力肽配体，利用小麦胚芽(wheat germ)提取物翻译体系，从肽文库经多核糖体筛选而鉴定出(Gersuk等，(1997)Biotechand Biophys.Res.Com.232，578-582)。有报道称，原设计用于增加三元复合体(ternary complex)产量、且允许形成二硫键的大肠杆菌翻译体系，被用来筛选功能性抗体片段(Hanes和Pluckthun，PNAS USA(1997)94，4937-4942)。该实验计划随后被用于从鼠文库中筛选抗体，结果表明，因PCR误差和筛选的组合效力，致使筛选期间发生了亲和成熟。获得了一种解离常数约为10^-11M的ScFv片段(Hanes等，PNAS USA(1998)95，14130-50)。还有人利用兔网织红细胞裂解物的提取物，从混合抗体群富集特异性抗体(He和Taussig(1997)NAR，5132-5234)。

mRNA展示与核糖体展示一样，利用mRNA与所编码的多肽之间的复合体作为基本筛选单元。mRNA展示不同于核糖体展示之处是，mRNA与蛋白之间连接的共价特性。这种连接通过小衔接分子实现，所述分子通常是嘌呤霉素(Nemoto等，(1997)FEBS Lett 414：405；Roberts和Szostak，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12297；Takahashi等，(2003)Trends Biochem.Sci.28：159)。mRNA展示并不限于4℃，而这是核糖体展示的常用温度。通常，筛选所用温度受蛋白靶标稳定性的限制。已有人用mRNA展示对肽和抗体进行亲和筛选(参见Lipovsek和Plückthun，(2004)J Immunological Methods290：51-97)。