[发明专利]稳定在电化学生物传感器中的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶的活性

说明书

发明领域

本发明总的来说旨在用于分析生物学流体的医学装置的领域。

发明背景

更具体而言，本发明涉及生物传感器，器用于测量体液中的分析物的量，特别是测量全血样品中的葡萄糖。光学方法通常用于进行此类测量，但本发明涉及电化学传感器的改良。

尽管本文将描述的本发明方法可以应用于测量其他分析物，但测量全血样品中的葡萄糖是特别感兴趣的。本发明还涉及电化学仪器，其中将恒定或变化的电势施加于接触血液样品的电极，并且在短时间段后测量所得到的电流。测得的电流与样品中的分析物的量相关。此类仪器称为电流计。

电流测量仪器中使用的葡萄糖生物传感器可以采用许多试剂系统，所述试剂系统使酶与样品中的葡萄糖反应，并通过称为介体的氧化还原化合物在下列一般步骤顺序中氧化而产生可测量的电流：

葡萄糖+E_氧化→E_还原+氧化的葡萄糖(葡萄糖酸内酯)

E_还原+n Med_氧化→n Med_还原+E_氧化

n Med_还原→Med_氧化+ne^-

其中E_氧化和E_还原是氧化和还原形式的酶氧化还原中心，并且Med_氧化和Med_还原是氧化和还原形式的介体。葡萄糖氧化酶已用作电化学生物传感器中的酶，但最近，已引入了葡萄糖脱氢酶。这些酶与辅酶或辅因子，例如NAD、FAD和PQQ一起使用。在本领域技术人员所熟悉的之中，介体尤其可以是铁氰化物或四唑盐。

将葡萄糖脱氢酶(GDH)、其辅因子以及介体组合在施加至电极对的制剂中，所述电极对被描述为工作和反电极。当施加电势越过电极时，所述酶/辅因子氧化葡萄糖(分析物)，并且当介体再氧化该酶时其被还原。还原的介体迁移至工作电极，在那里它被再氧化，并且在该过程中释放电子，所述电子移至反电极并建立电流，该电流与样品中存在的葡萄糖量成比例。

因为每当患者测试其血液葡萄糖量时使用一个新的传感器，所以试剂制剂应当在从一个生物传感器到下一个生物传感器之间提供一致表现。很明显，重要的是，结果是可靠的，因为用户将根据其测试结果来调整其饮食或药物治疗。因此，除了其他要求外，尤其是，酶应当在其整个有用的保存期内维持其活性。本发明特别涉及限制或防止在电化学生物传感器中使用的酶/辅因子系统[即，葡萄糖脱氢酶-吡咯并喹啉醌(GDH-PQQ)]的活性的丧失。

美国专利号6,656,702中提出了一种维持GDH-PQQ活性的方法，其教导了向试剂制剂中添加糖，特别是含GDH-PQQ的海藻糖。在一个例子中，将亲水性聚合物，羧甲基纤维素，沉积在电极上并干燥。然后，将包含GDH-PQQ、海藻糖和作为电子受体(介体)的铁氰化钾的试剂混合物通过“滴下(dropping)”而沉积在干燥的羧甲基纤维素层上并随后干燥，以在电极上完成试剂层。该专利还建议，还可将亲水性聚合物加到包含试剂的层上。认为‘702专利通过提及试剂层“滴下”来表示，它们通过将试剂小滴分配到围绕裸露电极的孔中来进行沉积。

另一专利(美国专利号6,270,637)描述了用于电化学生物传感器的制剂，其包含GDH-PQQ，并且还包含羟乙基纤维素。该专利强调了包含入分子量为100-900千道尔顿(kDa)的聚环氧乙烷的价值。没有详细提供将其制剂施加于电极上的方法，但相信这可以通过用泵系统分配试剂来完成。

试剂层的丝网印刷用于在美国专利号5,708,247；5,951,836；和6,241,862中所描述的组合物和生物传感器。葡萄糖氧化酶用作所述酶，并且试剂组合物还包括羟乙基纤维素和经处理的二氧化硅，选择所述经处理的二氧化硅以具有疏水性和亲水性的平衡，从而形成将红细胞排除在外的二维网络。

试剂制剂可以通过各种方法进行沉积，包括浸渍、条纹涂覆(stripe coating)、喷墨印刷或使用注射泵的微沉积，所述注射泵可以包括添加微型电磁阀液滴喷射装置。丝网印刷是特别感兴趣的方法，因为它是有效的并且可良好地进行调整以适应生物传感器的大规模生产。它要求施加于电极的制剂(即，墨)具有某些物理性质以成功地进行施加。特别地，通过丝网印刷施加的墨应当具有下列性质：与基材的吸附性、内聚性、触变性(剪切稀化)、以及关于粘度和流动的最佳流变学。