[发明专利]寡核苷酸的纯化

说明书

本发明涉及一种纯化寡核苷酸的方法。

寡核苷酸的合成长期以来一直是广泛研究的课题。已经开发了自动 合成方法并且用于自动合成的设备可在市场购得。这些方法的大部分被 开发用于相当少量的寡核苷酸(在mg范围内)。这些量足以满足大多数 研究目的。

特别是随着反义治疗的发展，大规模合成成为相当重要的问题。尽 管已经开发了相对大规模的合成方法，但是一个主要缺点在于中间体和 产物的纯化。对于小规模合成，反相HPLC是合适方法，其允许在短时 间内纯化mg量得到良好的纯化结果。对于大规模生产，反相HPLC需 要大量溶剂、昂贵的设备等，成为难以实施的方法。

现正需要纯化寡核苷酸合成产物的改进方法。

US 2003/0055241公开了一种制备纯化的寡核苷酸的方法，其包括 用凝聚剂和沉淀促进剂(precipitation enhancer)处理寡核苷酸的溶液。 该方法用于未被保护的寡核苷酸或5′被保护的寡核苷酸的纯化。沉淀促 进剂需要离子形式，以与分子相互作用。

EP 0 512 768 A1公开一种纯化DNA的方法。DNA由天然来源制备。

上述两种方法仅可用于未被保护的或几乎完全未被保护的寡核苷 酸。寡核苷酸在合成过程中受到保护，因此，US 2003/0055241和EP 0 512 768 A1的方法不适用。

本发明的目的是克服现有技术的缺点并提供一种寡核苷酸和中间 体的有效纯化方法，尤其是用于大规模合成。

在一个实施方案中，本发明提供一种用于纯化被保护的寡核苷酸的 方法，其包括如下步骤：

-提供被保护的寡核苷酸在至少一种溶剂A中的溶液，所述至少一 种溶剂A的沸点低于溶剂B的沸点；

-加热所述溶液到30℃以上并且低于所述至少一种溶剂A的沸点 的温度；

-加入溶剂B，直到所述溶液变混浊，所述溶剂B为具有1～6个 碳原子的醇或具有2～6个碳原子的二醇；

-在搅拌下使所述溶液冷却，直到形成上清液和残留物；

-移除所述上清液。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于纯化被保护的寡核苷酸 的方法，其包括如下步骤：

-提供溶剂B，所述溶剂B为具有1～6个碳原子的醇或具有2～6 个碳原子的二醇；

-加热溶剂B到30℃以上并且低于溶剂B的沸点的温度；

-加入被保护的寡核苷酸在至少一种溶剂A中的溶液，直到所述溶 液变混浊；

-在搅拌下使所述溶液冷却，直到形成上清液和残留物；

-移除上清液。

“变混浊”是描述溶液饱和的观察，例如不能再溶解被保护的寡核苷 酸。如果见到沉淀物，溶液就是混浊的。

“冷却”是指降低溶液的温度。通常冷却进行至到达室温(大约25℃)。 在一些情况下，优选进一步冷却，即到达至少20℃或至少10℃或0℃。

“被保护的寡核苷酸”是包含一个或多个保护基的寡核苷酸，所述保 护基例如在糖部分的5′、3′、2′位上和/或在杂环碱基上和/或在P-键(例 如磷酸酯或硫代磷酸酯)上。

术语“保护基”包括使用寡核苷酸之前不除去的基团，例如用于增加 寡核苷酸稳定性的修饰(modification)。

适用于2′-羟基的保护基包括但不限于：叔丁基二甲基甲硅烷基 (TBDMS)、三异丙基甲硅烷基氧甲基(TOM)、氟苯基甲氧基哌啶基 (FPMP)、和CH₂-O-Et、和不可切割的修饰如2T或2′MeO。

适用于3′-羟基的保护基包括但不限于叔丁基二甲基甲硅烷基 (TBDMS)、戊酮酰基(levulinyl)、苯甲酰基。

合适的修饰包括LNA(2′O-4′C亚甲基桥)。

合适的被保护的核碱基对本领域技术人员是已知的，例如N-4-苯甲 酰胞嘧啶、N-6-苯甲酰腺嘌呤、N-2-异丁酰鸟嘌呤、N-4-乙酰胞嘧啶或 N-4-异丁酰胞嘧啶、N-6-苯氧基乙酰腺嘌呤、N-2-叔丁基苯氧基乙酰鸟 嘌呤。合适的非碱基残基还包括氢(H)，从而产生1′，2′-双脱氧核糖(来 自Glen Research的dSpacer)，其在寡核苷酸中可以用作连接体或用来 模拟碱基位(Takeshita等人，J.Biol.Chem.，1987，262，10171)。