[发明专利]来自血浆的低聚糖的分析方法

说明书

本发明的目的是来自血浆的低聚糖的分析方法，这些低聚糖构成 低分子量肝素和非常低分子量肝素。

这些肝素是糖胺聚糖族的生物活性剂，它们具有特别有用的抗凝 血性。将肝素多糖长链切成低分子量短链，制备出这些低分子量肝素 (HBPM)和非常低分子量肝素(HTBPM)。

构成HBPM和HTBPM的低聚糖通常用宏观参数(例如它们的平均 分子量)或生物活性(例如aXa活性(IU/mg))进行表征。测量与抗凝血酶 III相互作用的方法是最常使用的方法。

然而，测量这些宏观参数与生物活性并不能回几个至关重要的 间题。特别地，不可能基于这些标准分析构成HBPM和HTBPM的不 同低聚糖的药物代谢动力学分布图。例如，aXa活性仅考虑了对AT III 有亲和力的种类，即仅约20％混合物；因此，80％低聚糖的性能没有 测定。此外，构成亲和性混合物的每个种类的份额不可能测量到。

因此，不可能精确地确定每种低聚糖的血浆浓度，更有理由地， 通过简单测定其aXa活性不可能精确地确定其药物代谢动力学分布 图。然而，这些分布图为改进HBPM和HTBPM基药品剂量提供了非 常有价值的信息。

为了能够分析血浆中构成HBPM或HTBPM的不同低聚糖的性 能，应该能够完全而再现地将血浆中的这些低聚糖与其它组分(特别是 蛋白)分离。现在技术描述的方法利用强蛋白酶处理(Volpi等人，1995， 《Biochim.Biophys.Acta.》，1243(1)，49-58)。

色谱法或电泳法有可能分析HBPM的不同组分。例如，采用毛细 管电泳法(EC)分离肝素低聚糖(Guerrini等人，《糖生物学》 (Glycobiology)，2002，12，713-719；Linhardt等人，《BioMethods》， 1997，9，183-197)。然而，EC的选择性比液相色谱法低得多。在某些 情况下，还可能使用MALDI-TOF质谱分析法分析肝素低聚糖，但这 种方法不能应用于复杂的混合物，更不用说它的高成本。

因此，特别地采用高效液相色谱法(CLHP)分析硫酸化低聚糖，如 构成HBPM和HTBPM的硫酸化低聚糖。最近(WO 2004/027087)描述 了一种HBPM分析方法，该方法包括酶解聚作用，接着如果必要进行 还原反应，与CLHP定量分析。最近欧洲申请(EP 04290789.9)公开了 采用阴离子交换色谱法定量测定构成HBPM和HTBPM的低聚糖的方 法。该方法利用反相硅胶柱动力学吸附季铵盐，特别地鲸蜡基甲基铵 的阴离子交换色谱法，它们在pH2-12范围内保持净正电荷并且不变。 在使用CTA-SAX柱进行HBPM和HTBPM的CLHP分析之前，这种 方法可能涉及预处理，解聚或采用排阻色谱法的分离。

本发明的目的是血浆低聚糖的分析方法，其特征在于进行下述两 个步骤：

-处理血浆样品，

-CLHP的定量分析。

在采用CLHP定量分析前，该方法既不涉及对血浆样品中的低聚 糖进行酶解聚，也不涉及采用排阻色谱法进行分离。另一方面，根据 这种方法，采用过滤方法处理这种血浆样品，以便分离这些低聚糖， 让它们在滤液中与血浆污染物，特别是留在浓缩物中的蛋白质再接 触。

因此，本发明的目的更特别地是如前面所定义的方法，其中采用 过滤方法处理这种血浆样品。本发明的一个非常特别的目的是如前面 所定义的方法，其特征在于分子量大于30kDa的分子留在该浓缩物 中。

为了能够对血浆样品处理方法进行量化，并验证这种处理在样品 间的再现性，如果必要往样品中添加内标。这个内标应该是一种低聚 糖，如果可能的话在结构上接近定量产物，该产物在过滤前才与血浆 混合。

本发明的另一个目的因此是如前面所定义的方法，其特征在于在 过滤前才往血浆样品中添加对照低聚糖。

尽管采用过滤方法将大多数低聚糖与蛋白质分离，但可能的是一 部分依然因与浓缩物的静电相互作用而被捕获。在这种情况下，必须 使用盐溶液对浓缩物进行一次或多次洗涤。

本发明的另一个目的因此是如前面所定义的方法，其特征在于该 浓缩物使用盐溶液进行至少一次洗涤。

根据本发明，该盐溶液优选地是氯化钾溶液。