[发明专利]编码多小片段RNA载体在基因干扰与基因激活中的应用

说明书

技术领域

本实用新型涉及生物技术，特别涉及RNA干扰和RNA激活技术。尤其涉及将编码多条(2条或以上)小片段RNA的载体中用于对同一或不同基因的激活，或是用于对不同基因分别进行基因干扰和基因激活的应用。

背景技术

RNA干扰技术1998年被发现，2001年5月被成功用于哺乳动物细胞，开始了RNA干扰技术的广泛应用。RNA干扰技术是利用21nt或29nt的双链RNA对目的基因进行封闭，达到干扰目的基因的作用。RNA干扰是生命最为古老的基因免疫监视机制。生命维持健康、抗御病毒侵入、抗肿瘤发生以及维持遗传稳定等等都可能是依靠RNA干扰实现的，所以，对RNA干扰的研究和RNA干扰技术的应用受到空前的瞩目。RNA干扰技术成功应用当年(2001年)就排在纳米技术之后被评为世界十大技术进步的第二位。2002年又被评为十大技术进步的第一位。RNA干扰技术正在飞速发展，2001年5月第一次哺乳动物细胞应用时是采用的化学合成的双链RNA，一年后推出了生物转录合成的双链RNA，2003年以后越来越多的人开始使用质粒载体表达的双链RNA。

一直以来，科学家认为RNA分子只能引起RNA干扰现象，即抑制基因表达。我国科学家，现任美国加州大学旧金山分校助理研究员李龙承博士于2006年首次证实RNA分子在人细胞中还具有基因激活功能，它能命令细胞在短时间内大量生产某个“有利”基因，比如在癌细胞中的抑瘤基因，从而达到治疗疾病的目的。

11月3日出版的美国著名《科学》周刊对该发现详细地做了介绍。同日，这一成果的论文发表在《美国科学院院刊》杂志上。《科学》周刊评价说：“如果该研究得到进一步确认，这项技术将成为一种强有力的生物学研究工具，而且一些疾病将得到全新治疗方法，比如癌症治疗。

用“RNA干扰”治疗某一肿瘤时需要有明确的致癌基因作为攻击目标，但不是所有的肿瘤能找到致癌基因；而“RNA激活”则可以通过选择性的激活或增强某个抑瘤基因的表达，来遏制肿瘤生长，但同样的问题则是并非所有的肿瘤能找到抑癌基因。所以具体采用哪一种方案，则要依问题的具体情况而定。

此外在许多应用环境中仅针对单一位点或是单独应用的“RNA干扰”或“RNA激活”往往效果不理想或是作用有限，特别是在某些代谢途径中存在多个环节，或是多个替代途径时，对单一环节的调节或是仅仅对一个途径的调节往往不足以达到预期目的。在这些情况下，一种能够将这两种机制的效果加强或是将两种机制结合起来的方案，将更有利于将RNA的调节作用应用于科研及医疗领域。

发明内容

本发明的目的是高效稳定地制备能够同时编码多条小片段RNA的载体，并将其

(1)应用于同一或不同基因的激活，以期达到对关键基因表达的有效激活；或

(2)用于对多个基因分别进行干扰或激活；

(3)无论是针对单一基因或是多个基因，也无论是用于RNA干扰或是RNA激活在，对于每个目的基因都可以有多个小片段RNA与其作用来降低筛选周期或是增强调节效果。

实现本发明的技术方案是：

(1)根据应用目的来确定目的基因的调节方案(干扰或激活)并设计每个基因所对应小片段RNA的数量，按照文献或经典设计原则选取各自的靶位点。

(2)化学合成编码各小片段RNA所需的DNA模板并构建入多小片段RNA表达载体中。

(3)将构建的多小片段RNA表达载体根据需要用合适的方式应用于实验对象(如细胞、组织或是活体)并测定应用结果。

本发明的有益效果：

(1)本发明中对任意基因的调节作用既可以是干扰也可以是激活，从而更有利于利用现有的基因研究成果，将小片段RNA的调节机制应用于科研或临床，即当前只要已知一个或数个和研究或疾病相关的基因时，无论它们是有正面作用还是负面作用，用本发明方法都可以有效利用这些信息对有正面作用的进行激活，对有负面作用的进行干扰。

(2)因当前RNA技术领域的局限，要达到有效的RNA干扰或激活，往往需要设计多个靶位点进行筛选；而将本发明提供的编码多小片段RNA载体应用于RNA干扰或激活时，同时多片段的应用可以减少筛选难度，在大多数情况下甚至可以避免筛选过程而一次达到预期效果，这对于当前成本高昂的生物科研及应用而言，可以显著降低科研成本及周期。

(3)当将多个筛选有效的RNA片段构建在同一载体时，其干扰或激活效果往往因协同作用而较之单一片段有所增强，特别是在几个片段单独作用效果都不是很高时这种增强效果尤其明显。