[发明专利]一种高效检测临床样品中结核分支杆菌复合体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及临床微生物核酸诊断技术领域，具体涉及一种灵敏度高、特异性强、高效检测临床样品中结核分支杆菌核酸的技术，该技术还包括一种快速、高效液化痰的方法，而且液化过程对痰内分支杆菌无杀死作用。

背景技术

分支杆菌科只包括分支杆菌一个属，按是否引起人和多种哺乳动物的结核病来区分，分支杆菌属又分为结核分支杆复合体(mycobacterium tuberculosis complex，MTBC)和非结核分支杆菌(nontuberculosismycobacterium，NTM)；结核分支杆菌复合体包括结核分支杆菌(M.tuberculosis，MTB)、牛分支杆菌(M.bovis)、非洲分支杆菌(M.africanum)和田鼠分支杆菌(M.micoti)，结核分支杆菌和牛分支杆菌是引起人结核病的病原，非洲分支杆菌是引起非洲热带国家人结核病的病原。结核分支杆菌可存在于结核患者咳出的雾滴中，其大小为1～5μm，当易感人群吸入该颗粒并进入呼吸道末梢时可引起感染。在肺泡内结核分支杆菌可被巨噬细胞吞噬并向全身扩散，通常宿主细胞介导的免疫反应限制了结核分支杆菌的增殖与扩散。但有些结核分支杆菌在感染很多年内可保持休眠状态。隐性感染结核分支杆菌的患者(即潜伏期感染患者)，通常纯蛋白衍生物(PPD)皮肤试验阳性，但无症状和无传染性。通常隐性感染结核的患者有10％的可能转化为活动性结核。

据中国疾病预防控制中心统计，2005年全国报告肺结核发病1259308人，死亡6713人，发病数和死亡数均居全国法定报告甲、乙、丙类传染病发病数、死亡数第一位；而2004年肺结核发病970279人，死亡1435人，2005年与2004年相比，发病率增长29.03％。由以上统计数字看，我国肺结核病的防治工作仍然任重而道远。

从全球范围来看，世界上有三分之一的人口感染了潜伏性结核病，并面临发展为活动性结核病的危险。在许多国家，艾滋病毒加快了结核病流行，同时多药耐药性也日益成为一大威胁。每年有170万人死于结核病，其中许多死亡的原因是感染未能得到诊断或确诊太晚以至于无法治愈。每年患活动性结核病的估计有900万人，其中大多数仍未得到实验室确认的诊断。每年采用最普遍的检测方法——痰涂片显微镜检查诊断和报告的结核病病例仅为大约220万例。其它病例是通过一种往往效率低、有时还耗费资金的综合方法来诊断，即肺部X线影像、细菌培养和推测。

因此，2006年10月25日，在日内瓦由热带病研究与培训特别规划(TDR)和促进创新诊断方法基金会发布的新报告《结核病诊断方法：全球需求和市场潜力》，其主要结论为：“在改进结核病检测方面存在着一个相当大的尚未开发的全球市场，可供低收入和中等收入国家诊断结核病开展更为有效和更可负担得起的检测。今天大多数结核病例发生在这些国家。”

该报告认为，就目前所使用的诊断技术而言，在全世界结核病患者或生活在结核病高危地区的人当中，大多数人都很难获得迅速而准确的检测。这是因为：

第一，痰作为肺结核临床检测的主要标本，其液化方法至今没有很好解决，因而结核分支杆菌核酸扩增检测技术和分离培养难以诊断潜伏期感染患者。临床上普遍使用的NaOH、NaOH-NALC、油酸、硫酸等方法虽然可以有效液化痰，但都很大程度(20～90％)地杀死痰样品中的结核分支杆菌。临床上涂片检查要求每毫升痰液中杆菌的量至少为5×10³～1×10⁴，而分离培养要求10～100个杆菌，对于潜伏期结核分支杆菌感染患者每毫升痰液中杆菌的量一般在1×10³以下，涂片检查显然不适用，而痰经过液化之后损失大部分乃至全部的结核分支杆菌，造成核酸扩增和分离培养难以诊断潜伏期感染患者。而报告《结核病诊断方法：全球需求和市场潜力》指出，全球每年有2.04亿人次需要作潜伏期感染检测。

第二，痰涂片检查、X线影像、培养检测可能没有准确地查明活动性结核病，尤其是艾滋病毒阳性患者。呼吸道和消化道是分支杆菌传染人的主要途径，结核临床检测标本包括痰、支气管肺泡灌洗液和支气管冲洗液、胃冲洗液、血、尿、粪、体液、组织等标本，艾滋病毒阳性患者通过消化道、血液等途径感染分支杆菌之后显然不能通过上述方法检出杆菌。

第三，痰涂片检查、X线影像、培养检测可能无法严格区分潜伏性和活动性结核病，以及疾病对药物的敏感性和耐药性。