[发明专利]一种检测人源化抗CD52抗体生物活性的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及到一种检测抗体生物活性的方法。

背景技术：

CD52又称CAMPATH-1抗原，该抗原表达于正常及恶性的B和T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞表面及男性的生殖系统组织，是一种存在于B淋巴细胞和T淋巴细胞表面的抗原。针对CD52抗原的单克隆抗体在体内可以暂时清除血液内的淋巴细胞，使免疫系统处于失效状态，使器官移植入患者体内，不会遭到患者免疫系统的排斥，抗CD52单克隆抗体在体内还能够导致抗体依赖性溶解细胞或杀细胞作用，从而清除血液、骨髓和其他受影响细胞中的恶性淋巴细胞。抗CD52单克隆抗体(CAMPATH-1系列)已经被广泛地用于临床治疗，此抗体为人源化抗CD52抗体，于2001年5月7日获得美国FDA批准上市，适应症为“烷化剂及氟达拉宾治疗无效的慢性B淋巴细胞性白血病”。

人源化抗CD52抗体为IgG1亚型，具有人类抗体可变区的框架区、恒定区，以及来源于大鼠单克隆抗体(Campath-1G)的互补决定区。人源化抗CD52抗体的分子量约为150kD。

对于抗体生物活性的检测方法通常有两类，一为基于结合某种类型的抗原(对于CD52抗体，为CD52抗原)上，而后再检测所结合的抗体的方法(ELISA，ADCC，CDC)，另一为已知浓度的标记抗体竞争结合(对于CD52抗体，为利用CD52表达的外周血单个核细胞或细胞系)的方法。

上述方法存在着许多诸如：利用合成的CD52抗原，合成的抗原与天然抗原相比亲和力较低，因此检测方法的灵敏度较差；利用天然的CD52抗原，来源困难(人类脾脏)，不同来源的抗原有很大的差异，纯化的抗原有聚集的趋势；利用抗CD52独特型抗体代替CD52抗原，检测的灵敏度低，或与血清Ig有不可避免的交叉反应；利用新鲜外周血单个核细胞，不同供者间CD52表达的差异，病毒污染，难以获得均一的足够量的一大批；其他膜抗原的差异导致的非特异结合；利用CD52阳性的细胞系，Fc受体导致的假阳性，检测灵敏度较差；ADCC或CDC方法，同位素的使用使可操作性下降，检测的灵敏度及精密度较差等问题。

发明内容：

为了得到长期传代稳定、密度均一的而且细胞膜表面稳定表达CD52抗原细胞的CD52阳性细胞，本发明的申请人进行了大量实验，得到了符合此要求的CD52阳性细胞CHO-C，并建立了利用此细胞对人源化抗CD52抗体生物活性进行检测的方法。

本发明的目的之一是公开一种检测人源化抗CD52抗体生物活性的方法，包括对样品及已知活性的参比品进行稀释、利用CD52阳性细胞进行竞争结合试验、流式细胞仪检测和结果计算几个步骤，其中竞争结合试验步骤中所用的CD52阳性细胞为CHO-C细胞。

上述检测方法的主要原理为转染CD52的CHO-C细胞，其细胞膜表面表达CD52，抗CD52抗体可与CD52特异结合。单纯研究荧光标记抗体与细胞的结合的情况，量效曲线应为“S”形，即随着标记抗体浓度的增加，荧光强度也逐渐增加，直至达到饱和；此时的IC₅₀可代表该抗体与CD52的结合活性，在靶细胞相同的情况下，IC₅₀值越小，抗体与CD52的结合能力就越强，即抗体的活性越好。若存在未标记抗体对标记抗体的竞争，在荧光标记抗体浓度固定(结合曲线的亚饱和点)的条件下，随着加入的未标记抗体浓度的增加，细胞结合的荧光标记抗体量逐渐减少，因此量效曲线呈反“S”形或“乙”字形；在靶细胞和标记抗体相同的条件下，IC₅₀值越小，则说明加入的未标记抗体与标记抗体竞争的能力越强，与CD52的结合能力越强，即抗体的活性越好。

本发明的另外一个目的，是公开了上述的CHO-C细胞，通过人CD52 cDNA的获取、表达载体构建、转染CHO细胞及筛选获得；其中人CD52 cDNA的获取和表达载体构建过程包括引物序列的设计、人CD52特异片段的获得及将该片段装入表达载体。

本发明进一步公开了得到上述的CHO-C细胞需要的引物序列：

有义引物：5’-CCACCATGAAGCGCTTCCTCTTCCTC-3’(SEQ ID NO.1)

反义引物：5’-CTCAACTGAAGCAGAAGAGGTG-3’(SEQ ID NO.2)

该对引物在互补区两侧分别加入了酶切位点用于装入表达载体。

本发明还公开了CHO-C细胞的表达载体，可以为pcDNA3.1、pcDNA4、pCEP4、pREP4之一，优选pcDNA3.1。