[发明专利]乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法

说明书

(本案为申请号200410089359.7的分案申请)

技术领域

本发明属于生物技术，涉及基因工程技术领域，具体地说涉及针对乙肝病毒基因的小干扰核糖核酸序列及制备方法。

背景技术

(1)乙肝病毒(HBV)的治疗现状

慢性乙型肝炎是我国的高发疾病之一，是导致肝纤维化和肝癌的主要原因。目前治疗乙型肝炎的药物主要是以α干扰素为主的免疫调节剂和以拉米呋啶、阿德福韦为主的核苷类似物，但治疗效果仍不满意。HBV DNA的持续复制是导致乙型肝炎慢性化的主要原因。因此有效抑制HBV DNA复制，是治疗慢性乙型肝炎和控制HBV持续感染的关键。

(2)RNA干扰的现状

最近，RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术的出现，给抗病毒疾病的治疗注入了新的活力。几十年来，RNA被认为仅仅是从DNA获取遗传信息，并将信息传递给蛋白质。但最近研究发现，小片段RNA(small RNA)发挥着基因调控的作用，它能关闭基因的表达，或改变基因表达的水平[1]。现实验研究已经证实在哺乳动物细胞中，21—23个核苷酸长度的双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，可有效降解特定的RNA，从而阻断蛋白质的表达[2，3]，这些特定长度的dsRNA被称为siRNA(small interfering RNAs)。进一步的机理研究发现，siRNA不仅能够在转录后水平沉默(transcriptionalgene silencing PTGS)特定基因的功能，还能在DNA和转录水平调节基因(transcriptional gene silencing，TGS)的表达[4]。现研究主要集中在转录后水平，siRNAs在细胞浆中形成后首先进入RISC复合体(RNA induced silencingcomplex)，在ATP和解旋酶等的作用下解旋成单链，反义链通过碱基互补方式结合到特定序列的RNA上，在RISC复合体的协助下切割特定RNA序列，从而降解RNA，使之无法翻译成蛋白质，造成该特定基因沉默(gene silencing)，失去功能[4]。同时，RNAi具有高度特异性，19对核苷酸的双链RNA(其3’端外挂2个脲嘧啶序列[5])几乎可以完全抑制基因的表达，而将其中的一个核苷酸突变掉后，它对基因的抑制作用就消失了，这对siRNA的应用是非常重要的，可以避免siRNA降解与靶mRNA同家族的其他的mRNA[5]。此外，已有研究发现，RNAi除了在转录后水平调节基因表达，而且能使同源DNA序列甲基化结构，因而在转录水平具有重要的调控作用，Mette等证实与NOSPro基因启动子区同源的23nt的dsRNA可直接引起目的基因的DNA序列的甲基化，导致转录失活[6]。

RNAi作为一种RNA基础上的细胞“免疫”系统，近来被应用于抗病毒感染和复制的研究中，并在HIV的体外实验中取得了较理想的结果，作用强度远远超过了反义核酸和核酶技术[7]。Rossi等将HIV-1编码rev的基因和与它同源的双链RNA共转染到293细胞中，rev基因的表达被显著抑制；同时将siRNA的抑制效应与反义RNA，核酶等进行了比较，发现只有siRNA组抑制了HIVrev-EGFP的表达，其抑制率达到90％，而反义RNA，核酶组与对照组无显著差异[7]，这一结果同样被Sharp等学者所证实[8]。在针对肝炎病毒基因的RNAi研究中，已有研究表明：针对HCV基因靶序列的siRNA能有效抑制HCV RNA的复制及病毒蛋白的表达[10]。由于RNA干扰采用的是双链RNA，它比较稳定，不易被降解，因此RNA干扰不仅在体外，而且在动物体内亦具有较好的效果。因此，RNAi现象的发现，被《SCIENCE》杂志和美国科学促进会评为2002年十大科学成就之一，具有广阔的应用前景。现今一致认为针对病毒基因的siRNA是最佳的治疗策略[9]。

(3)RNA干扰的5种方法