[发明专利]从原核生物中纯化人乳头瘤病毒晚期蛋白L1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用原核生物(特别是大肠杆菌)表达系统表达、纯化人乳头瘤病毒L1蛋白，并获得类病毒颗粒的方法。

背景技术

人乳头瘤病毒HPV(Human Papillomavirus)属乳头多瘤空泡病毒科(Papovaviridae)乳头瘤病毒属，为无包膜DNA病毒。病毒基因组为双链闭环DNA，大小约为7.2～8kb，具有8个开放框。基因组按功能的不同可以分为三个区域：①早期区(E)，约4.5kb，编码E1、E2、E4～E76个与病毒复制，转录及转化有关的非结构蛋白；②晚期区(L)，约2.5kb，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；③长调控区(LCR)，位于L区末端与E区起始端之间，长约800～900bp，不编码任何蛋白，含DNA复制、表达调控元件。病毒颗粒直径为45～55nm，核衣壳呈20面体对称，有72个壳微粒，由L1及L2组成。

目前已知的HPV约有90多种亚型，在人群中主要引起皮肤，粘膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系又可分为3组：①低或无致癌风险组，包括HPV6、11、39、41、42、43；②中度致癌风险组，包括HPV31、33、35、51、52；③高度癌风险组，包括HPV16、18、45、56。其中HPV16、18与妇女宫颈癌的关系尤为显著，约有59％的宫颈癌患者HPV-16 DNA阳性，12％患者为HPV-18DNA阳性。(Thomas，D.B.，R.M.Ray，et al.(2002).Cancer Causes Control 13(7)：683-90.)

HPV L1蛋白为主要衣壳蛋白，分子量为55～60kDa，是HPV疫苗主要靶蛋白。在多种表达系统中表达的HPV L1蛋白无需L2蛋白辅助即可形成在形态结构与天然病毒颗粒相似的类病毒颗粒(Virus-LikeParticle，VLP)，且它保留了病毒颗粒的天然表位，具有较强的免疫原性，可诱导针对同型HPV病毒的中和抗体。(Kirnbauer，R.，F.Booy，et al.(1992).Proc Natl Acad Sci US A 89(24)：12180-4.)因此，VLP疫苗已成为HPV疫苗发展的主要方向。

HPV VLP疫苗研制的关键是能够大量高效制备VLP样品。目前较为常用的表达系统可以分为真核表达系统及原核表达系统。

常用的真核表达系统有痘病毒表达系统、昆虫杆状病毒表达系统、酵母表达系统。痘病毒表达系统最早被用来制备HPV VLP，(Zhou，J.，X.Y.Sun，et al.(1991).Virology 185(1)：251-7.)。此后，相继有使用昆虫细胞表达系统及酵母表达系统制备VLP的报道(Hofmann，K.J.，J.C.Cook，et al.(1995).Virology 209(2)：506-18.)在真核表达系统中所表达的HPV L1蛋白天然构象破坏少，能自发的形成VLP，往往只需进行简单的密度梯度离心即可得到纯化的VLP，为纯化工作提供极大的便利。但是由于真核表达系统的表达量低，培养成本高，给大规模工业化生产带来了极大困难。

原核表达系统中大肠杆菌表达系统应用最为广泛。早在1987年，就有利用大肠杆菌表达HPV L1蛋白的报道(Banks，L.，G.Matlashewski，et al.(1987).J Gen Virol 68(Pt 12)：3081-9)。但是由于大肠杆菌所表达的HPV L1蛋白大多失去其天然构象，主要以包含体形式存在。虽然通过包含体纯化，复性等步骤也可得到HPV VLP(Kelsall，S.R.and J.K.Kulski(1995).J Virol Methods 53(1)：75-90)，但是在复性过程中蛋白损失量大，得率低，难以在大规模生产上应用。HPV L1蛋白虽然也可以在大肠杆菌中以正确构象可溶性地表达，溶解于菌体的裂解上清中，但是表达量较低，而且上清中杂蛋白种类多且量大，要从中纯化出目的蛋白难度相当大。虽然也有文献报道通过GST融合表达的方式可以增加上清中L1蛋白的表达量，而且有助目的蛋白的纯化(Li，M.，T.P.Cripe，et al.(1997).J Virol71(4)：2988-95.)，但融和蛋白的切割往往需要价格昂贵的酶，依然无法应用于大规模生产。

因此，本领域仍然需要改进生产病毒蛋白质(特别是HPV L1蛋白)的方法、纯化病毒蛋白(特别是HPV L1蛋白)的方法。

发明内容

本发明涉及如下编号的段落中所述的内容：