[发明专利]一种二维高效液相色谱装置及其应用

说明书

技术背景

本发明涉及高效液相色谱，具体地说是一种二维高效液相色谱装置及其通过同一检测器依次检测复杂体系样品中不同疏水性小分子组分的二维高效液相色谱方法。

背景技术

自上世纪70年代以来，高效液相色谱成为发展最快的分析化学分支之一。尤其是近年以来，随着生命科学和生物工程等领域的迅速发展，因具有分离检测过程温和，对沸点高、分子量大、极性强、热稳定性差的化合物特别是有生物活性的物质具有特别的处理能力等优点，高效液相色谱日益成为分析化学和生物化学实验室必备的分离工具(文献1.王俊德，商振华，郁蕴璐等.高效液相色谱法.中国石化出版社1992.3第一版p1.)。特别是将液相色谱和质谱联用，可以进一步增加峰容量，提高对复杂样品的分离分析能力。

作为一种灵敏度高、选择性强、无歧视性的分析技术，质谱在生物科学和分析科学领域的应用越来越广泛(文献2.Y.X.Zhu，P.S.H.Wong，M.Cregor，J.F.Gitzen，L.A.Coury，P.T.Kissinger，Rapid Commun.Mass Spectrom.14(2000)1695.文献3.L.D.Acevedo，Y.D.Xu，X.Zhang，R.J.Pearce，A.Yergey，J.Mass spectrom.31(1996)1399.)。但质谱只能分析气态离子，很多液相色谱中常用的非挥发性缓冲盐无法应用于液质联用系统中，而流动相的组成和流量对质谱检测灵敏度也有很大影响。这导致了液质联用技术在复杂样品分析中应用的局限性。

在高效液相色谱中，应用范围最广的色谱柱是十八烷基硅胶键合相色谱柱，即通常所说的C18柱。这种色谱柱基于反相分离机理，根据具体分析对象，通过调节流动相组成、柱温等条件，能满足多数极性较弱样品的分离要求；对于强极性和亲水性物质，需要通过添加离子对试剂等手段实现分离，但常见的离子对试剂多不挥发，无法与质谱在线联用。因此，在分析复杂样品时，为获取尽可能多的组分信息，常采用挥发性缓冲盐来满足与质谱联用的要求，同时增加流动相中水相的含量。即使这样，仍会有相当一部分强极性和亲水性组分在死时间流出，导致这部分样品信息的损失；同时，流动相中水相含量较高也会在一定程度上抑制质谱检测的灵敏度。

亲水反应色谱(Hydrophilic interaction chromatography，HILIC)是一类采用水溶性流动相，基于正相保留机理，分离亲水性物质的液相色谱法(文献4.Y.Guo，S.Gaiki，J.Chromatogr.A 1074(2005)71.)。其特征在于水是强洗脱剂，亲水性越强的物质保留越强。目前已有多种填料用于HILIC中，如氨丙基、酰胺基、二醇基、硅胶等(文献5.H.L.Koh，A.J.Lau，E.C.Y.Chan，Rapid commun.Mass spectrom.19(2005)1237.文献6.J.C.Valette，C.Demesmay，J.L.Rocca，E.Verdon，Chromatographia 59(2004)55.文献7.T.Yoshida，J.Biochem.Biophys.Methods 60(2004)265.文献8.Hiroyuki Tanaka，Xiaojing Zhou，OhiraMasayoshi，J.Chromatogr.A 987(2003)119.文献9.H.Schlichtherle-Cerny，M.Affolter，C.Cerny，Anal.Chem.75(2003)2349.)，用于分离糖、多肽、药物等极性小分子。因采用高有机相含量模式，不会降低质谱的检测灵敏度，HILIC非常适合和质谱联用。但与C18柱相比，HILIC柱有保留窗口窄，峰容量小的缺点。因此，如果能够发展一种新的液相色谱方法，针对生物样品、环境样品、天然产物提取液、体液等复杂体系样品中分子量小于1000的，性质各异，含量不等，蕴含大量样品信息、单根色谱柱选择性有限、分辨率和峰容量难以满足分离要求的非挥发性小分子物质，根据反相色谱柱和亲水反应柱各自的分离特点，分别分析复杂样品中的疏水性和亲水性组分，并利用质谱作检测器，将会大大提高方法的峰容量和分辨率，获得更多的样品信息。

发明内容