[发明专利]快速检测和鉴定烟草野火病菌及角斑病菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物病原细菌的分子生物学检测鉴定方法，尤其是涉及一种快速检测和鉴定烟草野火病菌及角斑病菌的方法。

背景技术

烟草野火和角斑病是烟草上最重要的细菌性叶斑病，发生普遍，条件合适可以突发性流行，而且可与多种真菌性叶斑病混发。由于单纯地依靠症状和常规的分离鉴定不能准确鉴别这些病害，往往无法指导病害的防治。

现行的植物病原Pseudomonas菌的鉴定主要是根据N.W.Schaad编著的《植物病原细菌鉴定实验指南》第二版(Laboratory Guide for Identification ofPlant Pathogenic Bacteria，2^ndedition，1988)、《伯杰氏细菌学鉴定手册》第八版和第九板(Bergry’s Manual of Determinative Bacteriology，8^thedition，1984，1994)、《伯杰氏系统细菌学手册》(Bergey’s Manual ofSystematic Bacteriology，9^thedition，1974)等书描述的的规范方法进行形态学分析和理化性状鉴定，包括培养性状、革兰氏染色反应、鞭毛的数量和着生位置、是否产生色素或荧光色素、一系列的生理生化特性，即采用Lellitt等1966年提出的一套鉴定荧光菌的LOPAT试验：果聚糖产生试验、氧化酶试验、马铃薯软腐试验、精氨酸双水解酶试验和烟草过敏性反应(Schaad WN，1998)、以及对寄主植物的致病性分析。这些传统的鉴定方法不仅费工费时、可靠性差、在结果的判别上受试验条件和试验者的主观因素影响较大，而且目前尚无法区分系列性状几乎完全近似的致病变种。在植物病原细菌的检测技术方面，现行的方法主要是血清学反应，利用多克隆抗体检测细菌菌体，但其灵敏性和特异性明显不足，不适于植物样品中的待测细菌数量较少时的检测。因此，从基因组或分子水平上检测鉴定植物病原细菌的分子生物学技术，已经成为发展的必然趋势。

野火和角斑病菌亲缘关系非常近，二者的培养性状、形态学特征和理化性状完全一致，基因组具有高度的相似性，病理学上二者的重要区别在于野火病菌可以产生野火毒素。但是它们都具有相同的hrpZ基因，基因全长仅有712bp，它们的hrpZ基因在DNA长度上和碱基序列上不同于其它任何的病原细菌，但在野火菌和角斑菌的菌株间却非常保守(同源性高达99％以上)，是分子生物学鉴定上非常有用的特征。因此，根据该基因特征序列设计引物扩增其hrpZ全长，完全可以将烟草野火菌和角斑菌同其他的细菌区分开来。此外，角斑菌又缺乏野火病菌的烟毒素(tabtoxin)合成基因(如tblA、tabA)，所以再依据GenBank数据库公开的有关基因序列设计特异性引物进行PCR扩增，便可进一步准确地鉴别出野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)和角斑病菌(pv.angulata)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种效果良好的快速检测和鉴定烟草野火病菌及角斑病菌的方法。

本发明的目的可通过以下措施来实现：

本发明方法是根据烟草野火和角斑菌中国菌株的hrpZ全序列，即野火菌株hrpZ Seq ID 001，角斑菌株hrpZ Seq ID 002，所设计的特异性寡核苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 003、Seq ID 004，以及野火毒素生物合成必需基因的特异性寡核苷酸PCR扩增引物对，即Seq ID 005、Seq ID 006。利用上述引物对，以细菌基因组DNA或菌落或经热激处理的病斑组织浸提液为模板，进行Taq DNA聚合酶PCR扩增，20～50ul反应体系，PCR产物用0.5～1.4％的琼脂糖凝胶电泳检查，根据电泳结果即可于2～5小时内快速鉴定出烟草野火病菌和角斑病菌。

本发明与传统的细菌鉴定方法相比，不仅方便、快捷，而且准确、可靠、特异性强。该方法的优点是，节约时间，提高了准确性和特异性；PCR检测鉴定法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较形态鉴定和生理生化鉴定方法更为准确；适用于单个病斑、细菌分离物或单个菌落的检测。既可进行定性检测也可进行半定量检测。

具体实施方式

本发明以下结合实施例作以详细的描述：

实施例1