[发明专利]一种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于新鲜大蒜中所含成分的分离纯化方法，尤其涉及新鲜大蒜中的蒜氨酸酶的分离纯化方法。

背景技术

1948年Arthur Stoll和Ewald Seebeck发现大蒜中存在一种酶，并把它命名为蒜氨酸酶。之后对蒜氨酸酶的研究一直没有中断，后来研究发现蒜氨酸酶(EC.4·4·1·4)是存在于大蒜中的一种内源酶，全称为S-烷基-L-半胱氨酸亚砜酶，其是一种均一的二聚体糖蛋白，大约占蒜中可溶性蛋白质的10-12％。完整无损的大蒜中，蒜氨酸酶和它的天然底物S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(蒜氨酸)等存在于大蒜的不同部位，蒜氨酸酶存在于液泡组织中，而底物则存在于细胞质中，只有当大蒜破损，两者才能相互接触，蒜氨酸酶通过氨酰基中间体与其辅助因子5’-磷酸吡哆醛结合在一起，经受β-消除-去氨基作用裂解底物成硫代亚磺酸酯。硫代亚磺酸酯类(R-S-S(O)-R)决定了大蒜的绝大部分特性，是大蒜特有的风味物质，是大蒜产生的各种含硫化合物的前体物质，也是大蒜具有许多生物活性功能的原因。故在大蒜加工过程中，蒜氨酸酶对于能否生产出硫代亚磺酸酯保留率较高的优质干燥大蒜制品至关重要，所以对大蒜中蒜氨酸酶进行分离纯化，以便对其性质进行研究，将具有非常重要的理论意义和实践意义。但直到80年代后才将此酶纯化为均一的酶，且纯化步骤较为烦琐。一般要对蒜氨酸酶粗酶液采用亲和层析的方法进行初步纯化，后采用Supherdex200凝胶柱层析才能得到纯度很高的蒜氨酸酶(如KuettnerBartholomeus E.的制备方法)。有人采用Sephadex G-200柱层析分离纯化了蒜氨酸酶，但此方法仅限于实验室分析，不能用于产业化生产。Rabinkov曾采用克隆技术将蒜氨酸酶克隆出来，这种方法较复杂。

发明内容

本发明目的是提供一种操作较简单的蒜氨酸酶的一步分离纯化方法，并且使分离纯化制得的蒜氨酸酶可达到电泳纯；而且这种方法可以使用于产业化生产。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：这种蒜氨酸酶的一步分离纯化方法是，在温度为0-4℃的条件下，按以下步骤完成：

a、均浆：把新鲜的大蒜粉碎，按每千克新鲜大蒜加入800-1200mL pH6-8

的缓冲液的量计算，在粉碎后的新鲜大蒜内加入缓冲液，同时进行搅拌使它们混合均匀；

b、提取上清液：将经步骤a所得物质进行冷冻离心处理，而后提取上清液；

c、盐析：在步骤b中提取的上清液内加入饱和硫酸胺溶液，加入同时进行搅拌；

d、溶解：把经过盐析后得到的上清液做冷冻离心处理，而后去掉上清液，留下滤饼，再把滤饼重新溶于pH7的缓冲液内；

e、超滤：把溶解后的滤饼用截留分子量为1万-5万的滤膜过滤，得到截留物，即为新鲜大蒜的蒜氨酸粗液；

f、分离纯化：把制得的新鲜大蒜的蒜氨酸粗液采用Sephacryl S-200凝胶柱进行分离：并用pH6-8的缓冲液以10-60mL/h流速进行梯度洗脱，同时用紫外检测仪在280nm进行检测，收集洗脱液组分；再把它透析得到纯化的蒜氨酸酶。

在步骤a中所加入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、甘油、NaCl、EDTA，和磷酸吡哆醛配制而成；在粉碎后的新鲜大蒜中加入缓冲液时，搅拌速度为每分鐘5000-10000转；

在步骤b中，均浆后的物质冷冻离心3-57分钟；

在步骤d中，把经过盐析后的物质，做冷冻离心的时间为10-50分钟；滤饼重新溶入的缓冲液为磷酸缓冲液，它由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、蔗糖、NaCl和磷酸吡哆醛制成；

在步骤e中，应将溶解后的滤饼先做冷冻离心处理，而后再进行超滤，超滤是在压力为0.25MPa的情况下操作的；

在步骤f中，缓冲液由NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、、磷酸吡哆醛制成。

在步骤a中所加入的磷酸缓冲液，其配制比例为：1000mL磷酸缓冲液由50-80mM的NaH₂PO₄、50-80mM的Na₂HPO₄、8-12％v/v的甘油、4-6％w/v的NaCl、4-6mM的EDTA、4-6μM的磷酸吡哆醛配制而成；