[发明专利]一种检测COL7A1基因突变的方法及其用途

说明书

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测COL7A1基因突变的方法，尤其COL7A1基因突变G26311T的检测方法，本发明还提供了该方法的用途，即在检测人类营养不良型大疱性表皮松解症的基因芯片或制剂上的应用。

背景技术

遗传性大疱性表皮松解症是由一组临床表现相关的疾病组成，按照电镜标准，以水疱在皮肤的位置为标准，可将其分为单纯型大疱性表皮松解症，交界型大疱性表皮松解症和营养不良型大疱性表皮松解症。

VII型胶原最早是由Bebtz等分离出的一种胶原，当时命名为长链胶原(LC)。Ryynanen等通过Northern杂交发现VII型胶原mRNA在角质形成细胞和口腔表皮癌细胞系表达。间接免疫荧光示19周的胎儿基底膜带有VII型胶原基因的表达，提示角质形成细胞也许是VII型胶原最初的细胞来源。1993年Greenspan等通过荧光原位杂交将编码VII型胶原的基因COL7A1定位于人3p21.3区域。Ryynanen等和Hovnanian等分别发现DDEB和RDEB都是由COL7A1基因突变所致。Christiano等检测克隆的VII型胶原cDNA序列发现其有118个外显子，是迄今为止发现的外显子最多的基因，其第一个外显子编码5’非翻译区信号肽，第2至第27外显子编码氨基酸球形NC-1区域，之后的84个外显子编码三螺旋区，113至118个外显子编码NC-2的其余部分。VII型胶原是锚原纤维的主要成分，当发生突变时，甘氨酸被替代，有可能改变了三螺旋结构的稳定性，使VII型胶原分子易被蛋白水解酶降解，使锚原纤维变细或数量减少。

COL7A1基因突变型和DEB表型近年来报道DDEB和RDEB都是由COL7A1发生突变所致。利用单链构象多态性(SSCP)及DNA直接测序等技术，对DEB患者及其家系进行基因突变的检测，取得了很大的进展。

DDEB和局限型RDEB的区别这两型患者在临床上和病理上难以区分。家族史很重要，但由于很少有大的家系或自发性突变(de novel)的DDEB的出现，更使两者难于区分。利用透射电镜也很难将两者区分，从而说明了分子生物学水平上阐明两者区别的重要性。Mallipeddi等通过对两个家系轻中度DEB四个患者直接测序，结果表明：两个患者的两个等位基因都存在突变，患者1的两条等位基因的突变型分别是Arg578 stop(R578X)和Gly2263 Val(G2263V)，其父母是杂合子；患者2的两条等位基因的突变型分别是Arg578 stop(R578X)和Gly2674Asp(G2674D)，无其父母血样，两患者均诊断为RDEB。这进一步证实了甘氨酸替代也见于隐性遗传的DEB，这种突变在杂合子中是显性失活的，只有在另一个等位基因上也存在突变时才有临床表现，而且临床表现的严重程度取决于第二个突变。所以DDEB只要找出一个突变即可，RDEB则要分别找出来源于父母的两个突变才能实现基因诊断。

Hammami-Hauasli等在研究了数例隐性营养不良型大疱性表皮松解症时发现，在73外显子发生的突变G2006D，G2034R，G2015E以显性失活的的方式，干预了VII型胶原的折叠和分泌，利用共焦激光扫描和免疫印迹方法研究，表明营养不良型大疱性表皮松解症的角质形成细胞的粗面内质网，聚集了高于对照组的变异的前VII型胶原。进一步分析表明，此三个突变均接近三螺旋区的绞链区。而显性营养不良型大疱性表皮松解症的突变位置更接近非胶原绞链区。

COL7A1基因突变的发现开辟了一个新领域。为营养不良型大疱性表皮松解症患者打开一扇新的诊断、治疗的大门。目前，通过国内外同行的研究发现了多个COL7A1基因突变位点，通过发现新的突变位点有利于进一步认识COL7A1基因对于皮肤组织生理功能意义，更加深入的了解其与疾病的关系。并且有可能存在着突变热点，这将有利于将来在临床上开展患者的COL7A1突变筛查工作，为患者产前诊断和治疗提供服务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测COL7A1基因突变的方法，该方法可以检测出人类营养不良型大疱性表皮松解症致病基因突变，本发明还提供了该方法的用途。

本发明提供的检测COL7A1基因突变的方法，其步骤包括：

(1)采用引物p87F和P87R对包含COL7A1(GenBank L23982)基因26124-26619位的碱基序列(序列表中序列1)在内区段进行PCR扩增；

p87F的碱基序列为：TGGGCCTGAAATATGAGGAG(序列表中序列2)