[发明专利]生物杀蚊剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物灭幼蚊制剂的制备方法。

背景技术

蚊虫是重要卫生害虫之一，也是最重要的媒介昆虫。它可以传播多种动物和人类疾病，包括痢疾、黄热病、西尼罗河病毒、病毒性脑炎、登革热、淋巴丝虫病，等等。据世界卫生组织(1999)估计世界上大约有二十亿人仍生活在这些传播疾病广为发生的地区。因此，我们需要新的药物与策略来控制这些疾病的传播。被认为是具有潜力的策略主要有注射疫苗和使传播性下降的转基因蚊子等，但在目前，将主要依赖于化学杀虫剂。自从第二次世界大战以来，传播性疾病控制的方法主要依靠使用广谱的化学合成杀虫剂来减少媒介蚊虫的数量，然而，由于化学合成的杀虫剂能使蚊子产生抗性；此外化学杀虫剂容易对环境造成污染，对水源与食物的污染会造成一些非标靶昆虫和一些脊椎动物的死亡，因此在很多国家化学合成杀虫剂已被限制使用。

世界卫生组织(1999)致力于用微生物杀蚊剂来代替化学杀蚊剂，用微生物控制媒介昆虫主要是通过控制蚊子的幼虫来实现，苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis subsp.israelensis(Bti))和球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus(Bs))是用得最广的杀蚊细菌。苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌是能运动的革兰氏阳性细菌，呈短杆状、能够在大自然中分离得到，它们在孢子形成时产生伴孢晶体，该晶体在昆虫体内消化后对昆虫具有致死作用。在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中，关键的杀蚊蛋白有Cyt1A(27kDa)，Cry11A(72kDa)，Cry4A(128kDa)和Cry4B(134kDa)；在球形芽孢杆菌中，杀蚊蛋白是Bin双元毒蛋白，它由两种蛋白质组成，一个是51.4kDa毒蛋白结构域和一个41.9kDa毒蛋白结构域，它们共结晶成一个小的类芽孢体。相比于化学杀蚊剂，生物杀蚊剂灭杀蚊子更专一且有效，而且本身也能够被大自然降解，因此不会造成环境污染。在发达国家，这些菌株制成的杀蚊剂型已成功地用于控制蚊幼的产生。

由杀蚊细菌制成的杀蚊剂在发达国家取得了一定的市场，但高昂的价格阻止了它们在发展中国家的使用，如中国、亚洲、非洲。而且，对于这些产品的广泛使用产生的抗性也引起了人们的关注，已经有好几个国家报道了球形芽孢杆菌在田间使用对库蚊属蚊幼的虫口数量的影响。抗性定义为在一段时间内对昆虫重复使用杀虫剂而造成的昆虫对杀虫剂敏感性差异，这种差异可以通过统计软件计算LD₅₀或LD₉₅来实现。潜在的抗性问题使我们在使用单一的杀蚊毒素时存在缺陷。由于苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌中的杀蚊毒素在生物化学与毒理学上的存在着明显差异，因此组合使用这两类菌株，或经重组工程菌产生此两类菌株中的毒素都能够有效的增强蚊幼对生物杀蚊剂的抗性，如通过混合球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的Cyt 1A蛋白或者是直接混合苏云金芽孢杆菌以色列亚种和球形芽孢杆菌能够显著地改善蚊幼致乏库蚊对杀蚊细菌球形芽孢杆菌的抗性，这种通过组合来改善蚊幼对杀蚊毒素的抗性在商业上是值得提倡的，但在此方面商业上的应用还较少。

近来，在杀蚊剂的研究中，重点放在对高杀蚊活性菌株的分离、改进和对制剂技术改善上。例如，美国专利U.S.Pat.Nos.5,275,815和5,847,079通过分离方法得到了一种新颖的杀蚊细菌苏云金芽孢杆菌；U.S.Pat.No.4,865,842发明了多种缓释剂应用于杀蚊剂中；U.S.Pat.No.4,166,112公布了用Bacillus ONR-60A的芽孢来控制蚊幼的方法；U.S.Pat.No.5,912,162公布了一种能够大量产生杀蚊毒素的发酵培养基。在中国ZL 03113555.2的专利“灭蚊制剂的制备方法及灭蚊制剂的应用”公开了一种采用苏云金芽孢杆菌以色列变种制备摇蚊幼虫杀灭制剂的制备与应用方法，对发酵液进行后处理得到液剂、粉剂或固定剂型的制剂，此种制剂对花翅摇蚊具有特殊高效，使用浓度内24小时对3龄幼虫的杀灭率达到98％。

包含有杀蚊细菌的发酵产物、或者是它的芽孢、或是分离得到的毒素的生物杀蚊剂。必须在施用地有稳定的货架寿命。要达到这种目的，发明的剂型中必须包含有防止活性物质免受化学因素、生物因素、物理因素和自然条件(如阳光等)降解的物质。因此，为了得到有效的杀蚊活性，发明能使活性成分在应用地域高性能的分散剂型是必要的。