[发明专利]高抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种高抗凝活性抗人组织因子单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

正常人体中，血管内的促凝血和抗凝血活性保持着适当的平衡。在动脉粥样硬化、高血压、高血脂、糖尿病等病理因素的影响下，该平衡可能向促凝血方向倾斜，最终导致血栓形成，引起急性心肌梗死、急性脑梗死和急性肺栓塞等危及生命的疾病。因此需要有效、安全的抗凝血剂来治疗特殊的血栓性疾病。

组织因子(tissue factor，TF)是一个跨膜糖蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞内区三个部分。在正常生理条件下，TF不和血液接触。只有当血管受损时，暴露于血管内皮下的TF及胶原将导致凝血因子和血小板的活化并随后形成止血栓子。TF既是凝血因子VII(FVII)在细胞表面的受体，又是FVII或激活的FVII(FVIIa)的辅因子，能进一步催化激活凝血因子X(FX)和IX，这两种因子分别是内源性凝血途径和凝血酶原复合物的关键成分，可导致凝血酶的快速形成。凝血酶将纤维蛋白原降解为纤维蛋白，后者随之聚合成纤维蛋白凝块。TF广泛存在于动脉粥样硬化斑块的细胞和非细胞成分中，斑块的破裂使其核心中有活性的TF暴露于循环血液，这是造成急性血栓形成的重要原因。

针对动脉血栓性疾病，现有技术已经研制了众多的抗凝血药物，包括肝素类药物、血小板聚集抑制物、凝血酶抑制剂等。上述药物所针对的靶蛋白均位于凝血途径的中下游，理论和实践上都达不到最理想的抗凝效果，且这些靶点蛋白在正常血液循环中，都有一定量的生理浓度，在疾病状态使用这些药物时，由于可能出现过度抑制，因此可能发生出血等不良反应。

虽然人体内存在TF的天然抑制物-组织因子途径抑制物(TFPI)，但TFPI不仅能够抑制TF，还有抗炎作用。也就是说，如果使用TFPI治疗血管损伤引起的血栓性疾病，TFPI的抗炎作用有可能成为不良反应。此外，TFPI在血液循环中的半衰期甚短，使用时所需剂量极大。因此，研制TF单克隆抗体即可以克服TFPI针对性不强和半衰期甚短的缺点，同时也可为血栓病的治疗提供新的手段。

抗人TF单克隆抗体是否具有抗凝活性，与TF单抗和TF抗原亲和力的强弱关系不大，而是取决于TF单抗是否封闭了TF与相互作用的凝血因子的结合部位。TF与FVII结合形成的复合物除了具有启动凝血途径的作用以外，还具有广泛的信号转导作用，是重要的细胞增殖信号复合物。因此，如果抗人TF单抗阻碍了TF与FVII的结合，可能会导致一系列的生理功能紊乱。如果仅是针对TF和FX结合部位的单克隆抗体则能阻止TF/FVIIa复合物的凝血激活作用，对正常的生理功能影响甚小。

迄今，尚未见有关具有高效抗凝活性的抗TF单克隆抗体的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的具有高效抗凝作用的抗人组织因子单克隆抗体及其制备方法。所述的单克隆抗体是由组织因子多抗原肽(TF-MAP)免疫制备的鼠源单克隆抗体。

本发明的另一目的是提供所述的抗人组织因子单克隆抗体在血栓病治疗和与TF相关的疾病诊断中的应用。

本发明综合应用蛋白质结构生物学、生物信息学、抗体工程等技术，获得了具有高效抗凝活性的抗TF单克隆抗体，能在血栓病治疗和与TF相关的疾病诊断中发挥重要作用。

本发明通过特异的多抗原肽免疫小鼠，制备具有高效抗凝血功能的抗人组织因子单克隆抗体。

本发明首先运用疏水性、柔韧性、同源性和空间结构抗原表位预测分析等方法，寻找并确定了TF与FX相互作用区域的氨基酸序列(TFP)。将此序列采用化学合成的方法在多聚赖氨酸介质进行人工合成，形成TF-MAP。

本发明提供了一种识别人组织因子可预测表位的单克隆抗体。

本发明提供了一种杂交瘤，它产生识别人组织因子可预测表位的单克隆抗体。

本发明的杂交瘤优选TF 4A12。

由本发明的杂交瘤产生的单克隆抗体构成了本发明的一个方面。

发明详述：

本发明的单克隆抗体识别人TF抗原。

本发明的单克隆抗体可通过本发明的杂交瘤产生，因此是可以从培养本发明的杂交瘤的培养液或用本发明的杂交瘤免疫小鼠从其腹水中获得。然而，产生本发明的单克隆抗体的方法不受特别的限制，如果基因工程化的抗体能与人TF特异性结合，它也在本发明的范围内。

本发明的杂交瘤产生的识别人TF特异性部位的的单克隆抗体，可通过经TF-MAP免疫的动物的脾细胞或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞融合获得。