[发明专利]重组人甲状旁腺素(1～84肽)的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人甲状旁腺素(1～84肽)的方法，包括有关的基因的优化、工程菌的构建、重组人甲状旁腺素(1～84肽)的表达和纯化工艺。

背景技术

PTH的基本生理作用是刺激破骨细胞骨吸收，使钙、磷从骨骼中释放，促进肾小管对钙重吸收、抑制磷回吸收，增加25-(OH)D3在肾脏转化为1，25-(OH)2D3，促进肠道对钙、磷的重吸收。研究表明，PTH能直接增加破骨细胞数目，增加破骨细胞皱折缘，提高破骨细胞活性，促进骨吸收。然而PTH并非直接作用于破骨细胞，它通过作用于成骨细胞，刺激其释放破骨细胞刺激因子，促进骨吸收，还促进成骨细胞产生蛋白酶及氧自由基产生，改变骨骼微环境，活化破骨细胞。低浓度PTH能够刺激大鼠成骨细胞增殖、促进骨合成代谢。PTH诱导骨形成的作用与胰岛素样生长因子-I、-II(IGF-I、-II)和β转化生长因子(TGF-β)有关。PTH还能短暂而迅速地促进c-fos等早期反应基因表达，c-fos基因对于PTH调节成骨细胞功能与分化具有重要作用。

甲状旁腺素是由甲状旁腺主细胞合成和分泌的一种单链多肽激素，成熟PTH含84个氨基酸残基，分子量约为9500，分子中不含半胱氨酸和酪氨酸，是维持血钙恒定的主要激素。人血浆中PTH有三种存在形式，除了完整的激素外，还包括分子量约7000和4500两种降解产物。

目前hPTH(1～84)、(1～38)及(1～34)片段已被应用于临床研究，PTH(1～84)及PTH(1～34)已进入III期临床药理研究阶段，有望最早上市。目前已有的PTH制剂价格昂贵，需注射给药，限制了其长期应用，开发经济、方便的PTH制剂十分必要。

生物工程技术的兴起及发展使得生物大分子的体外表达成为可能。PTH基因序列的阐明也为建立体外高效表达体系的研究奠定了基础。Born等(1987)将preproPTH基因导人到大肠杆菌中进行了表达，发现prepro序列不能提高PTH的分泌表达，可能是由于原核生物对真核生物的prepro序列不能识别。随后，Born等将目光转向酵母，然而天然蛋白质在酵母细胞中表达很不稳定，另外一个问题是酵母细胞不易破碎。因此，preproPTH基因在酵母中表达产量较大肠杆菌体系没有明显的提高。Rabbani等(1988)将人工合成的PTH基因在大肠杆菌中表达，产物不均一，包括了PTH(8-84)，PTH(3-84)，fMet-PTH和完整PTH。为了提高目标产物的稳定性，人们想到用融合蛋白形式。Hogset等(1990)采用金黄色葡萄球菌蛋白A的启动子和信号肽序列在大肠杆菌中表达PTH，产物分泌到培养基中，分离纯化方法简单迅速。酵母6因子表达系统也是比较理想的融合蛋白表达体系，即用外源基因代替α因子的编码序列，外源蛋白会与α因子引导肽形成融合蛋白。在一系列与膜相关的蛋白运输和分泌过程中，融合蛋白在KEX2基因产物类胰蛋白酶和STE13基因产物二肽氨肽酶作用下生成具有正确高级结构的外源蛋白。这些外源蛋白或直接分泌到培养基中或在细胞周质空间积累。采用α因子表达系统在啤酒酵母中表达PTH，也出现产物不均一现象，除了完整PTH，还有两个不同的糖基化形式。Sung等(1991)改造了PTH基因的核苷酸组成，利用简并密码使PTH(1～5)区域富含腺嘌呤，使表达产量有很大提高。Paulsen等(1995)用生物反应器培养细菌，以β-半乳糖苷酶-hPTH融合蛋白方式表达产生hPTH，并建立了大规模纯化方法，这使hPTH大规模生产方面取得较大的进展。

尽管人们采用不同的表达体系以提高PTH的表达量，但由于其分子内无二硫键，本身不稳定，以及mRNA的不稳定，PTH的表达量都比较低。因此，迫切需要开发新的高效生产重组hPTH的方法，本发明采用了大肠杆菌表达系统表达hPTH，通过对hPTH基因的优化，并考虑到PTH基因较小，构建含有优化的hPTH基因的融合表达载体，并获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高融合蛋白表达率；在此基础上对可溶表达的rhPTH的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了高纯度、高得率、可供动物实验的rhPTH蛋白。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人甲状旁腺素(1～84肽)的方法。

本发明的另一目的就是提供优化的重组人甲状旁腺素(1～84肽)的编码序列和用于该方法的表达载体及工程菌株。