[发明专利]应用浊点系统进行甾体生物转化制备睾酮的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域。具体涉及浊点系统在甾体生物转化制备睾酮中的应用。

背景技术

微生物转化疏水性化合物常受到一些因素的严重制约：底物在水中的溶解度小，限制了其生物利用度，而且产物/底物对微生物存在着抑制和毒害作用。这些问题在生物降解有毒污染物时也经常遇到。非水介质因其独特的功能在生物转化中起着重要的作用，近年来取得了很大的进步。本发明人已经开发了一种新系统，该系统是非离子表面活性剂胶束溶液，在温度高于其浊点或有诱导物存在的条件下，会自动分相形成表面活性剂稀相和富含表面活性剂的凝集层相。即采用一种或一种以上非离子表面活性剂形成浊点低于微生物转化培养温度的水溶液系统即浊点系统(cloud point system，CPS)，作为微生物转化的介质。在CPS中，形成了油包水和水包油的微观乳浊液。表面活性剂液滴具有增溶能力，充当着底物的储藏库和产物的抑制剂。强化了底物的利用度，排除了产物的抑制。连续的表面活性剂相中存在水泡，相当于一个微反应器，能使微生物免受表面活性剂的毒害作用。CPS应该具有较好的生物相容性。底物、产物可在两相中实现不同的分配，基于两相系统的微生物转化可能排除潜在的产物、底物抑制或毒害。另外，如果产物和细胞能在不同相中分配就可通过萃取分离细胞以替代常规的机械分离。表面活性剂胶束溶液具有增溶作用，能显著地增加疏水性物质的表观溶解度，由此增强其生物利用度，刺激微生物转化。浊点系统的生物相容性和对底物生物利用度的强化作用已被证实。

甾体类药物是一大类在临床上具有特殊治疗作用，且其他药物无法替代的极其重要的药物。其中，睾酮(17β-羟基雄甾-4-烯-3-酮，Testosterone，TS)作为一种雄性激素药物，可以促进雄性动物第二性征的发育和性器官的成熟，近年来作为替代疗法被用于治疗男性患者的原发性或继发性性腺功能减退症。另外，睾酮是蛋白同化激素的重要前体物质，蛋白同化激素的主要作用在于改善蛋白代谢，促进蛋白质合成和减少蛋白质异生，减少钙、磷排泄，减轻骨髓抑制，恢复和增强体力、利尿降压等。由于其具有显著的抗衰老和抗癌作用，应用范围日益扩大。

本发明人在中国发明专利200510024193.5中公开了应用高产突变菌株偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)CGMCC No.1241制备睾酮的方法。

基于浊点系统在疏水化合物生物转化中的诸多优势，本发明公开了将浊点系统与高产菌株相结合运用于甾体生物转化来制备睾酮的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于通过设计合理的浊点系统提高生物转化产率，特别是提供通过甾体类底物转化生产睾酮的浊点系统的优化生产方法。实验证明，在浊点系统中表面活性剂浓度和底物浓度对转化产率具有较大的影响。本发明通过选择底物、表面活性剂浓度以及其它转化培养参数，建立了制备睾酮的适宜条件，转化效果与传统转化系统相比有明显提高。

本发明中微生物菌种采用偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)CGMCCNo.1241；转化底物是动植物甾醇，可选自胆甾醇、谷甾醇、菜油甾醇或它们的混合物。

采用本发明方法进行睾酮制备时，为促使固体甾醇底物更好地溶解，改善转化效果，特别在转化系统中添加非离子表面活性剂以形成浊点体系。转化培养基中可利用的碳源选自糊精、柠檬酸盐、甘油、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉，或它们的组合，含量为1.0％-6.0％；氮源可选自酵母粉、复合氨基酸、蛋白胨、玉米浆、尿素、硝酸盐、铵盐，含量0.2％-3.0％；转化中可适当添加磷酸盐、镁盐、钠盐等无机盐成分。

本发明采用CGMCC No.1241菌株在浊点系统中进行睾酮制备时，优选的转化培养基为葡萄糖2.0％-5.5％、酵母粉0.2％-2.0％、磷酸二氢钾0.5％-1.5％、动植物甾醇1.0％-4.0％；非离子表面活性剂采用Triton X-100和Triton X-114的组合，两者质量比是1∶0.8-1.2，混合表面活性剂优选浓度为5％-10％；优选转化pH为5.5-7.0；转化时间5-9天。

本发明中涉及的转化产物的分析采用HPLC方法，其中样品处理步骤、系统参数设置如下：

试样制备：取转化液2ml，定量加入丙酮8ml，振荡混匀后放置过夜。吸出上层清液1ml于15000rpm离心10分钟，取离心所得上清液供HPLC检测。

分析系统：Agilent 1100

色谱柱：C18，ODS，5μm，4.6mm×250mm，

检测波长：242nm