[发明专利]一种惰性载体吸附固态连续发酵生产克拉维酸钾的方法

说明书

技术领域

本发明属于抗生素生产领域，特别涉及一种惰性载体吸附固态连续发酵生产克拉维酸钾的方法。

背景技术

由于青霉素的广泛使用，某些细菌尤其是金黄色葡萄球菌对青霉素产生了耐药性；青霉素类和头孢菌素类药物均含有一个共同的β-内酰胺结构，属β-内酰胺类抗生素。当使用具有这种结构的抗生素时，部分病原菌通过产生β-内酰胺酶这一机制而产生耐药性。研究和临床应用结果表明，克拉维酸钾等β-内酰胺酶抑制剂可大大提高上述病原菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。

克拉维酸钾本身的抗菌活性很弱，但它是强力、广谱的β-内酰胺酶抑制剂。不论在体外或体内都能同耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，特别是同金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和奇异变形菌所产生的β-内酰胺酶结合，从而抑制耐药性细菌对β-内酰胺类抗生素的分解作用，恢复青霉素类及头孢菌素类抗生素对许多产生β-内酰胺酶的耐药菌的抗菌活性。

目前为止，克拉维酸钾的生产大多采用深层液态发酵法：菌种为棒状链霉菌，种子液和发酵培养基为含有黄豆粉和甘油的合成培养基，在液体发酵罐中进行发酵。为了保证链霉菌得到充足的供氧，需要持续不断的搅拌，不仅耗能大，而且搅拌产生的剪切力还会对损害菌丝体，影响其生长代谢。另外，克拉维酸钾产量不高，且容易分解，使得发酵液中浓度很低，导致产品分离成本很高。

惰性载体固态发酵是一种新的固态发酵方式，它是以固态惰性载体为固态发酵过程中的固相，以吸附在惰性载体上的培养液作为营养物，它具有很多优点：1)应用范围广。惰性载体固态发酵除了不能直接利用农作物原料，它的应用范围要广的多，将应用领域拓宽到了以前液态发酵一统天下的领域，大大拓宽了固态发酵的应用前景；2)惰性载体的性质稳定，回收方便，可重复使用；3)降低了产物分离成本；4)不需要机械搅拌，能耗低。惰性载体吸附固态发酵主要适用于好氧的高附加值产品的生产，比如克拉维酸钾和蛋白酶等。

针对克拉维酸钾生产中的问题和惰性载体固态发酵的特点，本发明采用惰性载体固态发酵法生产克拉维酸钾，并且设计特定的发酵罐，菌种为棒状链霉菌，使用含有甘油和黄豆提取液的液态培养基，发酵罐内填充多孔的惰性载体，可以吸附菌体和发酵培养基，其独特的界面环境十分有利于发酵系统的传热传质，菌体可以得到充分的供氧，不需要机械搅拌，节省了能耗，也避免了搅拌引起的菌丝体损伤，提高了发酵代谢产物中的克拉维酸钾浓度，节省产品的分离成本，并且可以实现连续化生产。

发明内容

本发明的目的是为了解决克拉维酸钾生产中耗能高、产量不高等问题，提供了一种惰性载体吸附固态连续发酵生产克拉维酸钾的方法，达到既可以提高发酵系统的传热传质，降低耗能，又提高产量的目的。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的惰性载体吸附固态连续发酵生产克拉维酸钾的方法，其步骤如下：

1)制备棒状链霉菌种子液

将购自中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心的棒状链霉菌Streptomyces，Clavuligerus，CCRC11518＝ATCC27064，其保藏号为CCMCC 4.3，接种于棒状链霉菌斜面培养基，29℃下接种培养；再接种于棒状链霉菌种子培养基中培养至产生菌丝体，得到棒状链霉菌种子液；

所述棒状链霉菌斜面培养基为高氏一号培养基，其所含组分及配比为：可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，MgSO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCL 0.5g，FeSO₄ 0.01g，琼脂15～20g，水1000ml；

所述棒状链霉菌种子培养基所含组分及配比：每1升棒状链霉菌种子培养基含甘油20g，黄豆粉提取液200g和胨5g/L，其余为水；其pH 7.0；

2)制备棒状链霉菌发酵培养基：

棒状链霉菌发酵培养基所含组分及配比为：每1升棒状链霉菌发酵培养基含甘油4～12g、黄豆粉提取液300g、胨10g、氯化锂20g、鸟氨酸2g和KH₂PO₄ 0.8g，其余为水；

3)发酵前的准备

将预先切成小块并经清洗干燥后的惰性载体装填于发酵罐内，所述惰性载体的装填高度为发酵罐罐体体积的1/4～3/4，发酵罐内距惰性载体充填层上方10cm处设置一其上布满直径1mm孔洞的分布板；盖好发酵罐盖后，在121℃下灭菌20分钟；

将步骤1)得到的棒状链霉菌种子液储于种子液储罐中；