[发明专利]细胞内含有巨大叶绿体的转基因植物细胞系、及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种细胞内含有巨大叶绿体的转基因细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

利用植物生物反应器生产口服疫苗已成为目前研究的热点。与传统疫苗相比，植物源性疫苗具有安全、稳定、高效的特点。随着生物技术的不断完善，植物生物反应器将会成为疫苗生产的有效途径，并部分替代传统疫苗的生产方式。

叶绿体基因组转化由Boynton等20世纪80年代末首次在单细胞植物衣藻中获得成功，之后多家实验室转化高等植物叶绿体获得成功，近年来的研究取得了突破进展，并成为国际植物生物技术研究的一个热点，尤其是有关叶绿体转化的高效表达特性的报道，使其在植物生物反应器的应用日益受到重视

与常规外源基因核转化相比，叶绿体具有独特优点：基因区域化高效表达、母性遗传避免转基因花粉传播、生物安全性高、不会产生基因沉默现象、可直接表达原核基因、产物区域化、可高效表达外源基因、以及利于同时进行多基因的转化等等。因此，植物叶绿体基因工程越来越引起人们的广泛关注。目前该技术主要应用于：叶绿体作为生物反应器生产疫苗等医药蛋白；获得抗虫、抗病、抗除草剂和耐旱的转基因植物。

但是，植物叶绿体转化也存在明显的不足，高等植物细胞约有50-200个叶绿体，叶绿体转化经过抗性筛选得到的植株一般是异质的(heteroplasmic)，即转化和未被转化叶绿体同时存在于转基因植株。这种杂合体遗传不稳定，目的基因表达产量不高。然而，获得同质化(homoplasmic)转基因植株正是叶绿体转化相对于常规细胞核转化的主要困难。因此，必须设法使转基因植株达到同质化(homoplasmic)状态。国内自90年代初期开展叶绿体遗传转化工作以来，已将编码氨基糖苷3′腺苷酸转移酶的aadA基因以及编码PPT(Phosphinothricin)乙酰转移酶的bar基因、编码苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白的Bt基因^]和人丙肝病毒融合抗原基因NS3C等成功地导入到高等植物的叶绿体基因组中，有些外源基因已获得表达。但分子检测表明，几乎所有转基因植株均未能达到完全同质化状态^]。如何才能快速获得同质化叶绿体转基因植株，已成为长期困扰我们而且也是亟待解决的难题。

外源基因向叶绿体基因组中的整合是通过同源重组实现的。关于如何提高同源重组的效率以及提高转化率和转基因株系的同质化程度，国外已有一些文献对此进行了报道。主要有如下几种方法：

(1)在转化前设法降低受体细胞中叶绿体DNA的含量。这可以通过使用DNA损伤试剂(DNA damaging agents)或用叶绿体DNA合成抑制剂处理受体细胞来实现。Boynton等报道在基因枪转化前，将受体细胞(Chlamydomonas reinhardtii)用5mmol/L的5氟脱氧尿苷(FdUrd，5 fluorodeoxyuridine)处理，使其叶绿体基因组的数量减少5-7倍，可使转化效率提高20-280倍^]；Kindle等用0.5mmol/L的FdUrd处理衣藻细胞，并将其置于弱光(0.1w/m2)下培养一段时间再进行转化，也得出了相似的结论；Ye等报道，用DNA促旋酶抑制剂(200mmol/L萘啶酮酸或30mmol/L新生霉素)处理受体细胞(Solanum nigrum)，可有效降低叶绿体DNA的含量，从而可用于提高高等植物叶绿体转化效率和同质化程度。

(2)紫外照射法：转化前，将受体细胞用低剂量(1.7×105ergs/cm2)的UV(＜280nm)短暂照射，可将转化率提高4倍。紫外照射可促进蓝细菌转化过程中外源序列的整合。

(3)野生型E.coli recA基因介导法：Cerutti等的研究结果表明，野生型E.coliRecA蛋白可使叶绿体DNA同源重组的频率提高15倍^]。因此，将E.coli recA基因导入叶绿体基因组中，可以提高DNA分子的重组频率从而提高转化子的同质化水平。