[发明专利]一种用转基因植物联产纤维素酶及其它酶的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及到利用转基因植物联产纤维素酶、木质素酶、半纤维素酶的方法，属于分子生物学领域。

二、发明背景

生物材料的可再生性和生物乙醇对环境安全无害的优点使得生物乙醇生产技术成为近十多年来许多发达国家的研究热点。大量的研究表明，针对不同的生物材料，选优良的生物转化体系，可以较大幅度地提高生物乙醇的转化效率，将其生产成本降低到与石油乙醇相同的水平上。

依据我国生物质资源中纤维基生物质多的特点，应开发这类资源乙醇发酵技术。2006年6月我国发布的《可再生能源发展专项资金管理暂行办法》，明确了要重点扶持发展生物乙醇燃料，用“秸杆、红薯、木薯、甜高粱”等制取的燃料乙醇。开发替代粮食资源，如以农作物秸秆为代表的各类木质纤维类生物质，及其相应的燃料乙醇生产技术，是未来解决燃料乙醇原料成本高、原料有限的根本出路。

木质纤维素转化为乙醇的步骤主要分为两步：纤维素水解成糖，糖发酵成醇。由于木质纤维素结构复杂，纤维素、半纤维素不但被木质素包裹，而且半纤维素部分共价与木质素结合，纤维素具有高度有序晶体结构。所以，影响纤维素糖化分解的主要因素有木质素和半纤维素的保护作用，纤维素的结晶度、聚合度、有效比表面积、内部孔隙大小及分布等，要直接对纤维素进行糖化水解或生物转化是相当困难的。例如，秸秆中的非水溶性木质纤维素很难被酸和酶水解，主要是因为纤维素的结晶度、聚合度以及环绕着纤维素与半纤维素缔合的木质素鞘所致。木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种大然屏障，使酶不易与纤维素分子接触，而木质素的非水溶性和化学结构的复杂性，导致了秸秆的难降解性。因此，要彻底降解纤维素，必须首先解决木质素的降解问题。

利用木质素酶可以降解木质纤维素原料中的木质素，从而提高纤维素的水解效率。但要实现木质纤维素原料的有效糖化水解，提高原料利用率，降低生物乙醇生产成本，必须采用纤维素酶、木质素酶和半纤维素酶的复合酶制剂。

目前国外对生产纤维素酶、木质素酶及半纤维素酶的研究非常活跃，特别是用微生物发酵生产纤维素酶方面取得的长足的进展，从转基因工程到定向进化等。然而，由于采用微生物发酵生产上述酶的成本目前还较高，用所生产的酶去转化生物质材料生产燃料乙醇，缺乏市场竞争力。所以，许多研究转向将酶在植物中表达。Dail等〔Improved plant-basedproduction of El endoglucanase using potato：expres-sion optimization and tissuetargeting.Mol Breed，2000，6(3)：277-285〕从嗜酸耐热菌中得到的一种热稳定性的葡聚糖内切酶E1基因，表达在马铃薯茎叶中，葡聚糖内切酶含量为可溶性蛋白的2.9％，此酶量足以将植物中的纤维素降解。另外有研究将葡聚糖内切酶表达在似南芥的叶子[Accumulation of a thermostable endo-l，4-p-D-glucanase in the apoplast ofArabidopsis thaliana leaves.MolBreed，2000，6(1)：37-46]，以及烟草中[Productionof microbial cellulases in transgenic crop plants[A].In：Himmel M E，Baker J O，Saddler J N(Eds).Glycosyl hydrolases for biomass conversion[M].Washington DC：Americal Chemi-cal Society，2001，55-90]。专利WO98/11235将纤维素酶表达在植株的叶绿体，但是，仅用纤维素酶来降解植物中的纤维素，效率很低。美国专利US5,981,835将纤维素酶E2、E3表达在烟草和紫花苜蓿的细胞质中，然而，由于纤维素酶可能从细胞质中露出，进人细胞壁并降解其中的纤维素，影响了植物生长。美国专利6,013,860构建了转基因植物，将纤维素酶E1表达在质体。