[发明专利]从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明涉及从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的方法。

背景技术

肥胖是指由于能量摄入超过消耗，导致体内脂肪积聚过多而造成的疾病。据世界卫生组织统计：全球肥胖症患者达3亿人，其中儿童占2200万人，11亿人体重过重。肥胖与多种疾病的发生相关，是糖尿病、心脑血管病、高血压、胰岛素抵抗、胆结石、某些癌症的危险因素，此外，由此带来的健康问题还包括生殖与性功能障碍、负重关节的疾病、精神失常、意外伤害。因此，肥胖已成为全球性的公共卫生问题。随着肥胖发病率的日益增高，迫切需要新的、有效的且安全的治疗手段帮助肥胖患者减轻并进一步维持体重，同时降低与肥胖相关的心血管疾病方面的危险因素。

目前国际上减肥药物的开发主要依据两个原理：抑制食欲和减少脂肪吸收。其中，后者可以在维持正常饮食的前提下达到控制体重的目的。来自饮食的脂肪酸有50％-70％是通过胰脂肪酶的水解作用产生的^[1]，因此胰脂肪酶在脂肪的吸收方面具有重要的作用。胰脂肪酶抑制剂能通过减少饮食中的脂肪吸收，减少人体的热量摄入，达到控制体重的目的，并进一步减少与肥胖伴发的疾病危险因素发生的可能性。这类药物的代表产品是赛尼可，这类产品可以抑制大约30％摄入脂肪的吸收。

[1]F Carriere，J A Barrowman，R Verger et al.Secretion andcontribution to lipolysis of gastric and pancreatic lipasesduring a test meal in human[J].Gastroenterology，1993，105(3)：876-88

中药是以中医理论为基础，用于防治疾病的物质的总称，其来源有植物药、动物药、矿物药。中药具有二千多年临床用药历史，是人类经过了自身长期的筛选所积累的宝贵资源。研究表明，一个单味中药的化学成分数以百计，中药是一个数量庞大，资源丰富的天然的混合化合物库。但中药往往成分复杂，作用机理不明确。基于胰脂肪酶对于脂肪吸收的重要性，通过建立胰脂肪酶抑制剂筛选模型，以中药提取物库为对象进行筛选，是开发疗效明确、机理清楚的减肥新药的一条可行途径。

发明内容

本发明的目的是提供用于从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的筛选方法。

因此，本发明涉及一种从中药中筛选胰脂肪酶抑制剂的方法，其包括：

a.将胰脂肪酶采用固相包被方法包被在酶标板上；

b.洗涤后加入活化剂孵育一定时间使酶活化；

c.洗涤后加入中药提取物样品孵育一定时间；

d.洗涤后加入底物试卤灵甘油酯反应一定时间，利用酶标仪测定反应一定时间后生成的终产物试卤灵(resorufin)的荧光强度，该产物具有荧光，EX＝572nm，EM＝590nm，通过与对照孔荧光强度的对比，计算样品对胰脂肪酶的抑制率。

与常规的均相筛选方法比较，本发明采用固相包被和加样孵育后进行洗涤的方法，可大大减少假阳性结果的产生。例如，避免样品对底物影响造成的假阳性。具体讲，在胰脂肪酶催化脂类底物水解时，其通过吸附在乳化底物的脂-水界面上改变了自身的结构，从无活性的关闭构象转变为具有催化活性的开放构象，酶的催化位点暴露出来与底物结合。采用常规的均相筛选方法时，当体系中存在具有表面活性的物质时，这些物质覆盖在底物表面，妨碍了胰脂肪酶吸附到脂-水界面，最终导致底物水解的减少。这类具有表面活性的物质在中药提取物中广泛存在，如皂苷、长链脂肪酸等，会造成假阳性的筛选结果。同时也可减少样品对酶反应干扰造成的假阳性。具体讲，中药样品的特点是成分、浓度都不明确。在常规的均相筛选体系中样品中存在的多种物质可能通过非特异吸附、自身荧光对检测结果的干扰等因素导致阳性结果。采用固相包被方法，将样品与固定化的酶孵育一定时间后洗涤，可以除去不与酶结合或与酶结合力弱的物质，从而减少对酶反应的影响，减少假阳性。

进一步讲，本发明除了可以应用在胰脂肪酶抑制剂的筛选之外，对脂蛋白脂酶、磷脂酶等作用于非水相底物的脂水解酶，由于它们普遍存在界面活化的催化特性，因此本发明对建立这类酶抑制剂筛选模型具有指导意义。

附图说明

图1胰脂肪酶SDS-PAGE电泳图谱(箭头处为纯化样品)

图2均相反应体系中胰脂肪酶的标准曲线

图3不同酶包被浓度下的反应结果

图4TT对酶反应的影响

图5阳性对照赛尼可在酶的活化与非活化状态下对酶反应的抑制