[发明专利]一种治疗类风湿性关节炎的DNA疫苗及其用途

说明书

发明领域

本发明涉及一种重组核酸构建体，其含有与真核表达载体pcDNA3.1(+)有效连接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO：1)。本发明还涉及含有与真核表达载体pcDNA3.1(+)有效连接的CCOL2A1基因(SEQID NO：1)组成的重组表达载体。本发明还涉及所述重组核酸构建体用于制备治疗类风湿关节炎的DNA疫苗的用途，以及包含上述重组核酸构建体的治疗类风湿关节炎的DNA疫苗。本发明进一步的还涉及治疗类风湿性关节炎的方法，包括向受试者施用治疗有效量的所述DNA疫苗。

发明背景

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性侵蚀关节炎为特征的全身性自身免疫病。近年来国外趋向于将对免疫调节作用的药物作为治疗RA的第一线药，并对RA新的免疫治疗策略进行了广泛的探索。大量动物实验证实，II型胶原(CII)可诱发胶原性关节炎(CIA)，出现与RA类似的病理表现。这些研究提示，CII是诱导RA发病的主要自身抗原之一。通过给予CII抗原诱导免疫耐受，是国际上兴起的治疗自身免疫病RA的特异性免疫疗法之一。这些免疫耐受的机制包括主动抑制、克隆无能、克隆清除以及旁观者抑制等，这还有可能不是其全部的机制。其中有通过口服胶原，静脉、肌肉、皮下注射胶原等方法治疗CIA模型鼠取得很大成功，但在临床实验中治疗效果远不如动物模型中的治疗效果，其中的限制因素主要是抗原的用量、种类来源、性质、抗原呈递处理过程、宿主的遗传背景等。

目前国际上探索免疫耐受治疗RA所采用的CII均是天然提取制备的，很难保证产物的天然结构的完整性和抗原性，也缺乏正确的空间构象和适当的修饰。因此，这样的免疫原缺少在构象上相关的表位，难以诱导对应于天然抗原的免疫耐受。而且，CII作为蛋白质在体内存在半衰期短，病人需要重复给药的缺点，这也限制了CII的大规模使用。

采用DNA疫苗可以成功克服上述缺陷。DNA疫苗相对于传统的免疫策略具有的优势包括：(1)免疫效果好。DNA疫苗不需要提取CII，也不需要在体外原核或真核表达CII，也不需要对表达产物进行纯化、加工。CII基因直接在宿主体细胞内表达和后加工，能更完整地得到产物的天然结构和抗原性，也就是在宿主内有正确的空间结构和适当的修饰；(2)易操作性和稳定性。DNA序列清楚，纯化技术简便，质量易于控制。(3)外源基因在体内存在时间较长，不断表达外源蛋白，因此它可以持续给免疫系统提供刺激，无需重复施用蛋白质抗原；(4)能用各种投递疫苗的方法。如直接或脂质包裹后肌肉内注射，基因皮下枪接种，气枪肌肉接种，以气溶胶方式吸入或鼻内滴入，利用细胞内细菌传送DNA疫苗，利用病毒鼻内传递DNA疫苗以及经包装后口服等。(5)具有热稳定性，质粒的热稳定性远高于蛋白质，它不需特别的冷藏系统，可以加工成干燥的小颗粒，便于贮藏和运输。(6)规模化生产，成本低廉。由于其易操作性和稳定性，也决定了DNA疫苗生产成本相对低廉，这就为DNA疫苗在发展中国家的大规模使用铺平了道路。

本发明人在大量研究基础上采用鸡的II型胶原(CCII)基因制备所述DNA疫苗，其表达产物CCII与其它物种来源的CII相比在很多方面具有优势：(1)富含大量的硫酸软骨素A和粘蛋白，而粘蛋白中的硫酸葡糖胺含量最高，它们有着强有力的抗炎作用和软骨修复作用；(2)CCII能有效防止蛋白酶对关节软骨的消化破坏，重新编程已被破坏的软骨细胞和细胞因子，从而减少炎症的发生；(3)CII能促进软骨细胞及粘蛋白的合成，增加关节滑液及透明质酸的分泌；(4)CII是强有力的抗炎剂和疼痛缓解剂；(5)CII治疗十分安全无明显毒副作用，这也是目前任何其它治疗RA药物所不能比拟的。

发明内容

本发明人在成功获得鸡全长CII基因cDNA的基础上，选择真核表达载体，例如pcDNA3.1或者腺病毒作为载体，成功构建治疗性疫苗用于治疗RA。

因此，本发明的一个方面，涉及一种重组核酸构建体，其含有与表达调控序列有效连接的CCOL2A1基因(SEQ ID NO：1)。在本发明中，所述表达调控序列用于在真核宿主细胞中实现CCOL2A1基因的有效表达。