[发明专利]纳豆激酶的制造方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳豆激酶(nattokinase)的制造方法。

背景技术

血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率及死亡率居各种疾病之首。溶解血栓是治疗这类疾病的首选方法。但当前的溶栓剂，如尿激酶、链激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂等，存在半衰期短、副作用大、价格昂贵等各种缺点，难以成为适用的大众药品。1987年须见洋行在日本的传统发酵食品纳豆中发现了一种具有强烈纤溶活性的酶，定名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)。研究表明，纳豆激酶是一种丝氨酶蛋白酶(丝氨酸蛋白酶)，能显著溶解体内外血栓，明显缩短优球蛋白的溶解时间(Euglobulinlysis time，ELT)，并能刺激静脉内皮细胞产生纤溶酶原激活剂(t-PA)，从而更有效地发挥溶栓效果。因此纳豆激酶是一种很有潜力的新型口服溶栓药物。

目前，纳豆激酶的分离纯化工艺常采用传统的蛋白质纯化方法，如：有机溶剂沉淀、盐析、离心、凝胶色谱、疏水色谱、离子交换色谱等纯化方法。从固体发酵纳豆中分离纯化纳豆激酶的一种先前技术的工艺为：生理盐水抽提纳豆激酶，加入硫酸铵(硫酸氨铵)在25％饱和度下过夜，再于4℃，7000转/分钟离心40分钟，收集上清上5Butyl-Toyoperal疏水柱，收集活性峰再次进行饱和度25％的硫酸铵沉淀，取上清进行饱和度60％的硫酸铵沉淀，然后上CM-Toyopearl离子交换柱，收集活性峰再上Sephadex-G50，收集活性峰并透析过夜。采用上述工艺制造纳豆激酶，收率低，最终获得的产品很少。

1998年5月12日公告的第5,750,650号美国专利揭露了另一种分离纯化纳豆激酶的方法：从发酵液中提取纳豆激酶时，采用无水乙醇沉淀、ButylSepharose柱层析、脱盐浓缩后过阴离子交换柱(Mono-Q)，洗脱液再上疏水层析柱(Alkyl Sepharose)得到回收率为22.0％的纯纳豆激酶。采用此方法来分离纯化纳豆激酶虽然一定程度上提高了纯纳豆激酶的回收率，但回收率依然很低。

发明内容

本发明提供了一种回收率较高的纳豆激酶的制造方法。

本发明提供一种纳豆激酶的制造方法，其包括如下步骤：发酵，将纳豆激酶从纳豆菌(natto bacilli)中释放出来，发酵液中含有纳豆激酶及菌体；将发酵液中纳豆菌细胞的细胞壁破碎，释放出发酵过程中，卡在细胞壁的纳豆激酶；将细胞壁破碎后的发酵液离心并收集上清液；纯化所述上清液，获得纯化后的纳豆激酶溶液。

本发明提供的纳豆激酶的制造方法中，包括了细胞破碎的步骤，即将纳豆菌细胞的细胞壁破碎，将细胞壁破碎后，可以将在发酵过程中被卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶均释放出来。因此，相较于先前技术的纳豆激酶的制造方法，本发明提供的纳豆激酶的制造方法可较大程度上提升纳豆激酶的回收率。而且，针对同一发酵方法，本发明提供的纳豆激酶的制造方法可将纳豆激酶的回收率提升40～50％。

具体实施方式

本发明所提供的纳豆激酶的制造方法主要包括发酵、细菌破碎、离心(去除残渣)、精制(或称为纯化)等步骤，下面将逐步详述。

本发明所提供的纳豆激酶的制造方法第一实施方式详述如下。

1)发酵

从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入10毫升的种子培养基中，150转/分钟(rpm)下摇床培养8小时，按1％接种量接入发酵培养基中，再于28℃、150转/分钟下发酵罐培养100小时。发酵过程中，纳豆激酶会从纳豆菌中释放出来，液体中含有纳豆激酶及菌体。

2)细胞破碎

如上所述，在发酵过程中，纳豆激酶会从纳豆菌中释放出来。经研究表明，发酵只能释放出纳豆菌中所含有的部分纳豆激酶，约有50％左右的纳豆激酶受到纳豆菌细胞的细胞壁的阻碍，会卡在纳豆菌细胞的细胞壁而未能从纳豆菌细胞中释放出来，因此现有技术纳豆激酶的制造方法无法利用卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶，因此，总是无法达到理想的回收率。

为解决此问题，本发明提供了细胞破碎的步骤，即将纳豆菌细胞的细胞壁破碎。将细胞壁破碎后，可以将先前技术中被卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶均释放出来，因此，可较大程度上提升纳豆激酶的回收率。

本发明提供的细胞破碎步骤的第一种实施方式为：瞬间(一般为1秒以内)改变发酵液所处环境的压力，例如，可瞬间提升至2000磅/平方英寸(Psi)再瞬间降至常压，以使纳豆菌细胞壁破碎，此步骤重复进行，以使纳豆菌细胞充分破碎。

3)离心