[发明专利]亚铁离子诊断/测定试剂盒及亚铁离子的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种亚铁离子诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定亚铁离子浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

铁和总铁结合力在人体代谢过程中极为重要。铁是人体正常生理过程中不可缺少的物质。人体含铁约3～5g，其中70％存在于红细胞血红蛋白中；25％分布在单核巨噬细胞系统(即网状内皮系统，肝、脾、骨髓中铁蛋白和含铁血黄素)；4.9％分布于肌红蛋白、细胞色素、含铁的酶；0.1％为循环血浆中的铁。

人体内的铁来源于食物，主要在十二指肠和小肠上部被吸收。体内铁以铁蛋白和含铁血黄素形成贮存在骨髓、脾和肝脏内。有少量铁与血浆转铁蛋白结合，通过血浆输送至各组织，被利用或被贮存。

血清铁的测定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于灵敏度不高及基底的干扰，比分光光度法可靠性差。分光光度法应用一类含-N＝C-C＝N-结构的生色原，与亚铁形成五元环，产生紫红色。较早使用的有联吡啶和红移菲罗啉；近来多推荐灵敏度较高的亚铁嗪。此外，尚有应用铬天青S与高铁的反应。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)技术，连续监测转铁蛋白在460nm波长处吸光度的变化，得以测定亚铁离子浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的亚铁离子诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行亚铁离子浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明亚铁离子浓度测定方法原理如下：

这种方法应用需要亚铁离子激活的亚铁氧化酶(ferroxidase；EC EC1.16.3.1)酶促反应速率比色法。亚铁氧化酶酶促反应将脱铁转铁蛋白(apotransferrin；在460nm处没有吸收峰)氧化成为转铁蛋白(transferrin；在460nm处有吸收峰)，从而得以测定转铁蛋白在460nm处吸光度上升的速度，通过测量460nm处吸光度上升的速度，可以测算亚铁离子的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂还是双剂，如下成分关系的本发明亚铁离子诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                 200mmol/L

稳定剂                 50mmol/L

脱铁转铁蛋白           30mmol/L

亚铁氧化酶             12000U/L

本发明的亚铁离子诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、脱铁转铁蛋白、亚铁氧化酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、脱铁转铁蛋白。

试剂2

缓冲液、稳定剂、亚铁氧化酶。

脱铁转铁蛋白、亚铁氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

具体实施方式

下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。

实施例一

本实施例的亚铁离子诊断/测定试剂为单试剂，包括：

醋酸缓冲液                200mmol/L

稳定剂                    50mmol/L

脱铁转铁蛋白              30mmol/L

亚铁氧化酶                12000U/L

试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。

在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长460nm，测试副波长550nm，被测亚铁离子样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约1分钟左右，检测时间2分钟左右。

加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长460nm吸光度上升的速度，从而测算出亚铁离子的浓度大小。

实施例二

本实施例的亚铁离子诊断/测定试剂为双试剂，包括：

试剂1