[发明专利]铜诊断/测定试剂盒及铜浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种铜诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定铜浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

正常成人体内含铜量为80～150mg，血循环铜占总铜量的10％。血浆中约95％铜a₂球蛋白牢固结合，称为铜蓝蛋白(Ceruloplasmin)，经酸处理后才能与铜试剂反应。其余5％为游离铜。许多酶都含有铜，如细胞色素氧化酶、超氧化物岐化酶、尿酸氧化酶、赖氨酸氧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羟化酶等。与白蛋白疏松结合的铜是运输、吸收、排泄的重要形式和中间环节，也是合成各种细胞蛋白的原料。其它铜蛋白还有血铜蛋白、肝蛋白和脑铜蛋白。铜参与造血过程，主要影响铁的吸收、运送和利用。

生物体液与组织中铜的测定方法包括分光光度法，火焰和无火焰原子吸收分光光度法、发射光谱法、中子活化分析法和阳极溶出伏安法等。铜的分光光度法都是利用铜形成有色络合物。火焰原子吸收法利用铜离子在火焰中被还原为Cu⁰，从铜空心阴极灯发出的光波Cu⁰吸收的量与浓度成正比，用于血清、尿、组织中铜的测定。阳极溶出伏安法是将铜离子作为汞齐被镀于阳极上，电压变得更正，使Cu从阳极“剥下”或再次溶解，形成的电流与Cu的浓度成正比，广泛应用于环境分析。中子活化分析是利用中子将⁶³Cu转变成不稳定⁶⁴Cu同位素，后者衰变时释放γ射线可在1。34MeV计数，应用于特定研究中心。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定铜浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的铜诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行铜浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明铜浓度测定方法原理如下：

赖氨酸+氧+水  赖氨酸氧化酶/Cu²⁺  6-氨基-2-氧代己酸

                                          +氨+过氧化氢

氨+肌苷单磷酸+辅酶  鸟苷单磷酸还原酶  鸟苷单磷酸

                                      +还原性辅酶

这种方法应用需要铜激活的赖氨酸氧化酶(lysine oxidase；EC1.4.3.13；EC 1.4.3.14)酶(偶)联鸟苷单磷酸还原酶(Guanosine5′-phosphate reductase；EC 1.7.1.7)酶促反应速率比色法。赖氨酸氧化酶酶解赖氨酸反应产生氨，再通过(偶)联合鸟苷单磷酸还原酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的速度，通过测量340nm处吸光度上升的速度，可以测算铜的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明铜诊断/测定试剂盒较为理想：

缓冲液                     100mmol/L

稳定剂                     50mmol/L

辅酶                       3mmol/L

赖氨酸                     20mmol/L

肌苷单磷酸                 16mmol/L

赖氨酸氧化酶               12000U/L

鸟苷单磷酸还原酶           16000U/L

本发明的铜诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、赖氨酸、肌苷单磷酸、赖氨酸氧化酶、鸟苷单磷酸还原酶。

试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、赖氨酸、肌苷单磷酸。

试剂2

缓冲液、稳定剂、赖氨酸氧化酶、鸟苷单磷酸还原酶。