[发明专利]基于磁颗粒和微电极的体外检测方法、试剂盒及仪器

说明书

[技术领域]

本发明涉及生物医学领域的一种体外检测方法、试剂盒及仪器，更确切的说，是一种基于磁纳米颗粒和金纳米颗粒针对生物大分子物质进行体外检测的技术、相关试剂盒及由此技术开发的一种自动化检测仪器。

[背景技术]

目前生物检测通常采用光学方法，借助荧光标记、化学发光、酶联等手段，但是光学方法存在灵敏度较低，稳定性差，所需设备昂贵，不便于携带等缺点。

近年来，随着纳米技术、微电子技术和生物技术的融合，多学科交叉渗透，随之产生了电学检测方法。美国Northwest University的Mirkin教授率先实现了无需PCR扩增的炭疽DNA电学检测(Science 295，1503-1506，2002)，其简要过程如下(见图1)：1)常规的光刻法制备微电极，将DNA探针分子(P1)共价固定在微电极间隙；2)待测DNA分子、纳米金颗粒标记的DNA探针分子(P2)与P1探针分子杂交，纳米金颗粒将在微电极间隙聚集；3)银染液处理，在金颗粒表面选择性的沉积一层银，改变电极间的电阻(银染也是信号放大的一个步骤)；4)同时监测电流，探测DNA分子识别过程。这种基于的微电极的生物分子探测方法无需复杂的光学系统，便于检测仪器的集成，可做成携式的检测仪器；对于使用者而言，操作简单。

但是，这种检测方法也有其局限性，1)由于探针分子与基片的相互作用，探针分子间的相互作用，液体中离子在探针分子上的吸附，基片表面复杂的形貌，所以探针分子很难均一的分布、定向的排列在基片上；2)只有接近基片的待测分子才能与固定在基片上的探针分子杂交，大部分的检测分子游离于溶液，使得检测灵敏度大大减低(见图2)；3)银染过程中部分Ag⁺会形成Ag颗粒，非特异性吸附在电极基片上，背景噪声增加(Nano Letters 5，1475-1482 2005)；4)微电流检测在液相中进行，难以避免溶液中离子对电流的干扰，因此信噪比较低。

[发明内容]

针对现有技术的上述缺点，本发明所要达到的技术目的是提供一种高灵敏、特异性好的检测方法，并开发一种检测仪，从而解决目前存在设备昂贵笨重，灵敏度不高的不足。

技术方案，本发明提出液相杂交、银染，固相微电极检测的路线(见图4)，步骤如下：1)富集，利用特异性标记物1(L1)修饰的磁纳米颗粒在液相中富集待检测物质，待测物质可以为核酸、蛋白，包括DNA、RNA、抗原、抗体等；2)形成磁-金颗粒复合体，可加入特异性标记物2(L2)、金纳米颗粒，或直接加入金纳米颗粒标记的L2；3)银染，加入银染液在磁-金颗粒复合体表面选择性沉积一层银，4)分离，外加磁场分离银染后的复合体；5)电学检测，将银染后复合体转移至微电极上，干燥处理后测其阻抗。

液相杂交，有以下优点：1)采用葡聚糖或琼脂糖或壳聚糖修饰的磁颗粒，能够减少杂交、银染过程中的非特异性吸附；2)磁颗粒直径小于1μm，特异性标记物L1可以较均匀、有序地修饰到磁纳米颗粒表面；3)磁纳米颗粒大大增加了特异性标记物分子与待测样品的反应界面，能够有效地富集待测物质(见图3)；4)磁纳米颗粒均一分散在反应液中，反应更加接近生理环境。均匀有序的修饰，高反应界面，液相中均一分散使得反应时间更快、灵敏度更高、特异性更好。

固相检测，有以下优点：1)银染后，磁场分离磁-金颗粒复合体，去除未经Au催化产生的Ag颗粒，将复合体重新分散到溶液中，转移到微电极上，减少了Ag⁺在溶液中自发还原产生的Ag颗粒引起的背景噪声(Nano Letters 5，1475-1482 2005)；2)电学信号可靠，重复性提高；3)虽然检测物质不同，但银染及电学测量过程一样，可实现一个微电极芯片上同时测量多种物质或一种物质的多个样本。因此，我们的方案，更加灵敏、快速、稳定，特异性地检测生物大分子。

特异性标记物，根据核酸杂交及抗原抗体特异性结合原理，特异性标记物为DNA、RNA、抗原或抗体，其共同特点是L1、L2能同时和待测物质结合。

金颗粒、银颗粒可以催化Ag⁺在其表面还原成Ag，所以两者均可用于结合特异性标记物L2(Science 295，1503-1506，2002)。最近有文献报道一些酶也可催化Ag⁺在其表面还原成Ag，生成Ag颗粒，所以这些酶也可用来结合L2(Nano Letters5，1475-1482 2005)。

银染后复合体的分离方法，通过外加磁场分离银染后复合体具有快速、简便的优势，另外也可通过传统的离心法分离复合体。