[发明专利]转导肽－人源粒细胞集落刺激因子融合蛋白及其药物组合物

说明书

发明领域：

本发明涉及具有药用价值的融合蛋白，具体为转导肽-人源粒细胞集落刺激因子融合蛋白，编码该融合蛋白的核酸分子。本发明也涉及含有该融合蛋白的药物组合物。

发明背景

概述

粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)是一种多肽链的细胞生长因子，刺激骨髓细胞形成粒细胞集落形成单位，增加中性粒细胞(ANC)、单核细胞、T淋巴细胞数量。G-CSF主要作用于粒系祖细胞、粒系前体细胞增殖、分化，并增强成熟粒细胞的功能活性；增强ANC的吞噬作用，改善ANC活性氧的释放功能以加强其杀灭病原微生物能力，对机体应激防御系统有重要意义。

G-CSF的生物学性质

人G-CSF由单个基因编码，其基因位于17号染色体的q21-22区，长约2.5kb，有5个外显子和4个内含子；其蛋白质由174氨基酸组成，其间有2个二硫键连接而构成三级结构，分子量为22kD。天然的G-CSF含有糖基，糖基化位点位于Thr133，无N-糖基位点，糖基对G-CSF的生物学活性没有贡献，在E.coli中表达的G-CSF无糖基，但其功能与天然G-CSF无明显差别。

G-CSF的生物学作用是通过与效应细胞表面特异性受体结合而产生的。G-CSF受体是高亲和力受体，分布于造血祖细胞、中性粒细胞、内皮细胞、髓系白血病细胞、血小板以及T、B淋巴细胞。某些非造血细胞(如血管内皮细胞、胎盘细胞、小细胞、肺癌细胞及滋养层细胞等)也有G-CSFR存在。但受体密度相差很大，受体密度约37-1000个/细胞。受体与年龄、性别、外周血相中血红蛋白量、白细胞数、血小板的数量无关，而与骨髓中原始细胞的比例呈显著负相关，急性白血病患者G-CSF受体表达率明显低于正常。G-CSF受体的数量随着细胞的成熟而增加，因此，G-CSF受体的表达在某种程度上反映了细胞的分化程度。体外试验显示即使中性粒细胞上有较低水平的G-CSFR表达，解离常数很低(3pmol/L)，也能发挥G-CSF较高的生物活性，因此少量G-CSFR结合即可诱发很大的G-CSF生物效应。

1、G-CSF能特异性地诱导粒系祖细胞的增殖与分化

G-CSF作用的主要对象是粒系细胞，不仅可促进粒系祖细胞的增殖，并诱导其向终末分化。G-CSF对CD34⁺/CD33^-的骨髓祖细胞作用较弱，而对骨髓粒系定向细胞(CD34⁺/CD33⁺)有明显的促进集落形成作用。G-CSF刺激造血祖细胞的动力学研究表明：G-CSF可诱导较成熟祖细胞(早幼粒细胞)的细胞分裂，但不能促进早期祖细胞进入细胞增殖周期。CD34⁺的骨髓祖细胞的体外培养发现G-CSF独自不能维持原始造血祖细胞的自我更新，因此，G-CSF在造血中的作用时相为造血细胞分化晚期。G-CSF与其他细胞因子(IL-3，IL-12，IL-1B，IL-6)共同作用对造血祖细胞的生长有协助作用，同时G-CSF还能影响一些造血调控因子如GM-CSF，IL-3对原始及多能祖细胞的反应。

在体内，G-CSF能促进粒系祖细胞的增殖、分化及成熟，并促进骨髓中中性粒细胞和干祖细胞释放于外周血中(Tsuruta T，Tani K，Shimane M，et al.Br J Haematol，1996；92：9)。G-CSF可使外周血中造血干/祖细胞数量增加10倍，这为外周血造血干细胞移植提供了理论依据。G-CSF作为干细胞动员剂，不但使外周血干细胞移植变得更为可能，且避免了细胞毒性干细胞动员剂所带来的骨髓抑制，目前已被临床广泛采用。此外，骨髓移植后G-CSF能明显加速粒细胞的恢复，增强粒细胞的功能，可缩短发热天数和抗生素应用时间。单剂量的G-CSF皮下注射，2小时后，可见外周血中中性粒细胞数量增加，这一作用12小时达高峰，持续36小时后逐渐恢复到原有水平；骨髓中同时伴有髓祖细胞的增加，祖细胞集落形成及骨髓S期细胞比例增加，但对单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、网织红细胞及血红蛋白等均无明显影响。