[发明专利]高产杆状病毒的棉铃虫幼虫脂肪体细胞系及其构建和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种昆虫细胞系，尤其是一种来源于昆虫脂肪体组织，并且对杆状病毒高敏感的细胞系，本发明还涉及该细胞系的建立方法，以及该细胞系在杆状病毒规模化生长上的用途。

技术背景

据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过500种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。昆虫细胞系作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具，而且昆虫细胞作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，表达了大量的具有重大经济意义或科学意义的外源蛋白质；同时作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒用作生物杀虫剂，特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂，昆虫细胞也发挥了重要的作用。

大量的来源于鳞翅目昆虫商品化的细胞系已得到人们广泛的应用，比如，来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf-21和其克隆株Sf-9，来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn-368和其克隆株Tn-5B1-4(商品名为High Five)等，已经成功的应用于表达和生产重组蛋白。

鳞翅目的细胞系来源于很多组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。然而，值得一提的是，由于昆虫细胞不完全的去分化，有的已经建立的昆虫细胞系仍然保持一定原始组织和器官的特征。来源于不同种类昆虫的细胞系或来源于同一种昆虫不同组织部位的细胞系扩增病毒或重组蛋白的表达能力各有不同。因此建立和筛选新的、更多的杆状病毒敏感细胞系(株)是一项非常有必要而且有理论和实践意义的工作。

到目前为止，来自棉铃虫(Helicoverpa armigera(Hbn.))的细胞系共有约10株(McIntosh，1983；Yang and Xie，1983；Su D.M.，1987；Kolokol`tsova，1995；McIntosh，1999；SudeepA.B.，2002A；Sudeep，2002B)McIntosh，A.H.等(McIntosh，A.H.，et al.In Vitro 1983，19：589～590)使用雌蛹的卵巢为材料，首先建立了棉铃虫细胞系 BCIRL-HA-AM1。通过接种试验发现，此细胞系不能复制美洲棉铃虫单粒包埋核多角体病毒(HzSNPV)、棉铃虫多粒包埋核多角体病毒(HaMNPV)和苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核多角体病毒(AcMNPV)，既没有多角体出现，病毒的浓度也没有增加。Lenz等(L-7，Lenz，C.J.，et al.，J.Invertebr.Pathol.57：227～233；1991)于1991年克隆了此细胞系，得到了细胞株CSIRO-BCIRL-HA1，此细胞株对HaMNPV非常敏感。杨淑艳等(杨淑艳，谢荣栋.In：中国科学院上海昆虫研究所，ed.昆虫学研究集刊(第三集).上海：上海科学技术出版社.1983：129-136)也建立了两株来自雌蛹卵巢的细胞系(SIE-Ha-798和SIE-Ha-806)。Su D.M.等(Su D.M.，et al.In“Biotechonology inInvertebrate Pathology and Cell Culture”(K.Maramorosh，ed.)New York：AcademicPress，1987，375-383)发表了另一株来自雌蛹卵巢的细胞系(SFE-HA-831)。1995年，俄国学者Kolokol`tsova T.D.等(Kolokol`tsova T.D.，et al.，Vopr Virusol 1995，40：135～138)也使用棉铃虫雌蛹的卵巢建立了一株细胞系。McIntosh，A.H.等(McIntosh，A.H.，et al.，In vitro Cell.Dev.Biol.1999，35(2)：94～97)后来从棉铃虫雌成虫的卵巢组织中建立了三株细胞系CSIRO-BCIRL-HA1，CSIRO-BCIRL-HA2，CSIRO-BCIRL-HA3。三株细胞系虽然对HzNPV敏感，但复制产生病毒的量并不如细胞株BCIRL-HA-AM1-A11多。细胞系NIV-HA-1195(Sudeep A.B.，et al.，Indian J.Exptl.Biol.2002，40：69-73)是通过棉铃虫幼虫血细胞建立的，该细胞系对AcNPV，斜纹夜蛾核多角体病毒(SpltNPV)和HaNPV敏感。Sudeep A.B.等(Sudeep A.B.et al.，In Vitro Cell Dev.Biol.-Animal 2002，38：262～264)建立了细胞系NIV-HA-197，它来自棉铃虫的胚胎，对AcNPV，SpltNPV和HaSNPV敏感，90％的细胞能够感染HaSNPV。