[发明专利]一种组织工程化皮肤的构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及将来自不同组织的干细胞在体外向表皮细胞定向诱导分化，并将诱导分化的细胞群与生物材料相结合，共同构建组织工程化皮肤的方法，利用此方法可在支架材料上制备用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和愈合的具有特定形状、厚度的皮肤组织替代物。

背景技术

皮肤作为人体的最大器官，具有屏障、保护、调节体温和感觉的功能。由于炎症、溃疡、烫伤、烧伤等因素造成的皮肤缺损，严重的可危及生命。目前临床通常采用自体皮瓣或皮肤移植的方法治疗缺损创面，但面临供皮区新的创伤缺陷，以及供皮区来源的不足。此外移植物与移植部位临近的皮肤存在颜色、质地、功能上的差异。

组织工程学是应用工程学和生命科学的原理和方法，构建生物性替代物，以恢复、维持或增进受损器官或组织功能的一门科学(Nerem RM.Tissue engineeringin the USA.Med Biol Eng Comput，1992，30(4)：CE8)。组织工程学的建立和发展为皮肤缺损治疗开创了崭新的途径。

目前应用于临床的组织工程产品主要有合成性敷料、人工皮片、人工真皮替代物和人工复合全层皮肤。Integra^TM是由美国Integra Life Sciences公司生产的双层基质的人工真皮。其真皮是由牛肌腱的胶原蛋白及硫酸软骨素制成具有一定孔洞大小的支架，利于血管内皮细胞通过和纤维细胞长入，表皮是由硅胶膜组成，可在真皮层愈合后除去，再进行人工表皮的移植。美国FDA于1996年核准Integra^TM用于烧烫伤的治疗。然而，Integra^TM由于缺乏活的细胞成分，可能延缓真皮的重建。

还有一类是含有单一细胞的皮肤，如人工表皮和人工真皮。  Epicel^TM是由美国Genzyme组织修复公司生产的人工表皮，主要用于治疗大面积烧烫伤病人。它是将病人自体的角质细胞在体外放大培养，移植到溃疡、痔、大疱性表皮松懈症部位。虽然它们在残留的真皮部位黏附得很好，但它们不黏附脂肪、慢性创面或感染性创面；而且移植部位容易剥离，或者形成水疱，对机械损伤高度敏感；缺乏真皮成分；移植成功率主要与创面细菌污染程度有关；费用昂贵。Dermagraft^TM是由Advanced Tissue Sciences公司生产的人工真皮。是将新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于生物可降解的聚乳酸纤维网上，移植后14天，成纤维细胞大量增殖并分泌胶原等细胞外基质以及细胞因子，3～4周聚乳酸纤维网因生物降解而消失，用于治疗糖尿病引起的足部溃疡。但生产这种合成网膜真皮替代物需要大量成纤维细胞；难以改变网膜的厚度；市售产品只达到真皮重建。

Apligraft^TM是第一种商业化的既含有表皮层又含有真皮层的组织工程化皮肤，由美国Organogenesis公司生产。它是将新生儿包皮中获取的成纤维细胞接种于牛的I胶原蛋白中，6天后细胞分泌细胞外基质，形成类似真皮层的组织，再种植上新生儿包皮的角质细胞。角质细胞附着在真皮上开始分裂分化形成表皮层。再将整个复合物置于气-液界面继续培养，促使角质细胞成熟。虽然Apligraft^TM实现了一次外科手术同时重建真皮和表皮的目的，但由于采用同种异体细胞作为种子细胞来源，因而存在着不可避免的免疫排斥反应，以及潜在的病源微生物感染的风险；而且所用的种子细胞均为终末分化的成熟细胞，没有自我增殖分化的能力。

发明内容

本发明提供了一种利用干细胞体外向表皮细胞诱导分化后的细胞群与生物材料结合，共同构建组织工程皮肤的方法。利用此方法可在支架材料上制备用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和愈合的具有特定形状、厚度的皮肤组织替代物。由于干细胞具有多向分化潜能，能够在诱导条件下分化为表皮细胞，通过诱导分化的细胞及其分泌的可溶性细胞因子及细胞外基质等活性成分的共同作用，能够加速缺损创面的愈合。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)体外诱导干细胞向表皮细胞分化