[发明专利]一种组织工程化双层皮肤的构建方法与应用

权利要求书

1、一种组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于：由向表皮细胞和向真皮细胞诱导分化的细胞群与生物材料共同构建而成。

2、根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于所述的向表皮细胞或向真皮细胞诱导分化的细胞包括从脐带血、外周血、骨髓、脂肪、胎盘、脐带等组织分离的干细胞经体外诱导分化而获得。

3、根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于所述的生物材料包括可降解型生物材料包括家蚕丝或柞蚕丝溶解提纯得到的丝胶、丝素及胶原、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、PLGA、PGA、PLA；还包括脱细胞真皮基质；非降解型生物材料如聚酰胺、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚氯乙稀、聚碳酸酯、聚四氟乙烯、硝化纤维。

4、根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，包括有不同组织来源的干细胞的分离、干细胞的体外诱导分化、与生物材料的共培养，其特征在于，本发明方法包括以下步骤：

(1)不同组织来源的干细胞的分离培养；

(2)不同组织来源干细胞向表皮细胞诱导分化；

(3)不同组织来源干细胞向真皮细胞诱导分化；

(4)胶原溶液制备和支持材料的准备；

(5)含有诱导分化的表皮细胞和真皮细胞的组织工程化双层皮肤的构建：

1)将脱细胞基质或者其它生物或者聚合物材料放在硅化处理过的培养板(或其它培养皿)中，将向真皮细胞诱导10～14天的细胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，计数，和胶原溶液混合均匀，按1×10³～5×10⁴个/cm²的密度种进支持材料中，加入适量含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基，静置10分钟，随后放入37℃，5％CO₂培养箱中培养，4h后将培养基吸去，换成真皮细胞培养液培养；

2)2天后将向表皮细胞诱导10～14天的细胞群消化，用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基重悬，计数，按2×10³～2×10⁵个/cm²的密度均匀种植于含有真皮细胞的材料表面；

3)2h后将培养基吸去，换成表皮细胞培养液进行培养，3天后换成气-液界面培养，继续培养7天后即可用于皮肤创伤的修复。

5、根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于用于诱导不同组织来源干细胞向表皮细胞分化的培养基是在低糖DMEM/DF12(1∶1)培养基中含有下列成分：EGF，bFGF，PDGF，ITS，地塞米松，青霉素，链霉素中的两种或两种以上的组合物。

6、根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于用于诱导干细胞向真皮细胞分化的培养基是在高糖DMEM培养基中含有下列成分：胎牛血清，TGF-β₁，bFGF，ITS，地塞米松，青霉素，链霉素中的两种或两种以上的组合物。

7、根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于用于干细胞向表皮细胞分化的一种诱导方案可以是：低糖DMEM/DF12(1∶1)培养基，15ng/ml EGF，15ng/ml bFGF，5ng/ml PDGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。

8、根据权利要求1所述的组织工程化双层皮肤的构建方法，其特征在于用于干细胞向真皮细胞分化的一种诱导方案可以是：高糖DMEM，5％胎牛血清，15ng/mlTGF-β₁，15g/ml bFGF，1％ITS，10mmol/L地塞米松，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素。

9、组织工程化双层皮肤的应用，其特征在于根据权利要求1所述方法构建的组织工程化双层皮肤可制备应用于临床烧伤、溃疡、创伤、畸形、术后缺损、疤痕等皮肤组织修复和愈合的皮肤组织替代物。