[发明专利]检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式－实时定量PCR方法

权利要求书

1.检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，包括以下检测步骤：

1)提取乙肝患者的乙肝病毒DNA；

2)设计合成引物与探针：在HBV DNA负链缺口两侧选择保守区域设计内、外引物，Taqman荧光探针设计于负链缺口下游，合成引物与探针；

3)Plasmid-Safe^TM ATP-Dependent DNase酶切纯化；

4)巢式-实时定量PCR扩增：

A.普通PCR用步骤2)中合成的外引物扩增纯化的模板；

B.实时定量PCR用步骤2)中合成的内引物和荧光探针对A的产物进行实时荧光定量扩增；

C.结果分析。

2.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤1)中乙肝病毒DNA提取自乙肝患者的血清、PBMC或肝组织。

3.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，，其中步骤2)中

设计外引物时选择的保守区域为：  1513-1589、1951-1876

设计内引物时选择的保守区域为：  1741-1823、1835-1926。

4.根据权利要求3所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤2)中

外引物序列及其位置：

5’GGGCGCACCTCTCTTTACG  3’    (1522-1540)

5’GTAACTCCACAGAAGCTCCA  3’    (1946-1927)

内引物序列及其位置：

5’GCTGTAGGCATAAATTGGTCT 3’    (1780-1800)

5’AGGCACAGCTTGGAGGCTTG  3’    (1884-1865)

Taqman荧光探针序列及其位置：

5’-FAM-CTCTGCCTAATCATCTCATGTTCAT-TAMRA-3’(1829-1853)。

5.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤3)中Plasmid-Safe^TM ATP-Dependent DNase酶切体系为：DNA产物10μl、10×Buffer2μl、25mM ATP 0.8μl、Plasmid-SafeATP-DNase 5u、dd-H₂O补足20μl，37℃温育30分钟，70℃温育30分钟，灭活Plasmid-Safe DNase。

6.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤4)A中反应体系为：纯化产物5μl，10μM外引物各0.5μl，2×TaqPCRMasterMix12.5μl，反应总体积25μl；循环条件：94℃预热5min，93℃45s、58℃45s、72℃1min，15～25个循环，72℃延伸10min。

7.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤4)B中反应体系为：普通PCR产物2μl，2×Taq PCRMasterMix12.5μl，25mMMgcl₂4μl，10μM内引物各0.5μl，10μM荧光探针0.5μl，反应总体积25μl；循环条件：93℃预热3min，93℃20s、55℃30s，40个循环。

8.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤4)C采用Real-time定量PCR仪对检测结果进行分析。