[发明专利]层叠杂交荧光放大磁分离检测DNA的方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种检测DNA的方法。

【背景技术】

自1953年华特逊(Watson)和克瑞克(Crick)创立生物遗传分子脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构和建立生物遗传基因的分子机理以来，有关DNA分子的识别、测序一直为人们所关注。1990年美国制定了世界最庞大的基因研究计划“人类基因组计划”，随着人类基因草图的公布，人们正在深入开展后基因组计划研究，为此，国际上掀起了有关生物芯片和生物传感器的研究热潮。基因控制着人类生命的生老病死过程，随着对基因与癌症及其它与基因有关病症的了解，在分子水平上检测易感物种及基因突变，对于疾病的治疗及预后有着重要的意义。比如，历史上许多灾难性的瘟疫(如霍乱、天花、麻疹等)，以及当前对人类造成严重威胁与恐慌的流行性疾病(如SARS，禽流感)都是由相应的病菌或病毒所引起的，因此及时尽早诊断出病源微生物的感染，是预防这类疾病的关键。对于许多基因疾病(如众多癌症、帕金森氏综合症、阿尔茨海默氏病等)，只有在发病的前期发现，才有治愈的希望。另外，人类的许多疾病都是以环境为载体进行传播的。当环境中存在病原微生物或基因诱变剂时，就会对人类的健康产生极大的威胁。如果能及时发现环境中病原物的存在，就可以尽早进行疾病预防，防止引起人体感染。因此，为实现对疾病的早期诊断乃至超前诊断，提高人类的生存质量，加强对DNA检测方法的研究和应用开发，实现DNA的低浓度检测具有重要的科学意义和应用价值。

在各种不同的基因检测技术中，制约其发展和应用的一个非常重要的因素是检测灵敏度。比如，对于滤过性病毒感染，需要检测的DNA量在10-15摩尔/升或10-18摩尔/升水平。为达到这样低的检测限，必须通过扩增样本量或寻求放大检测信号的方法。目前，新型纳米材料在生物分析中的应用成为一个快速发展的领域。过去10年来，纳米材料在生物大分子超灵敏识别分析和生物信息获取方面的基础与应用研究在国际上一直受到高度重视。研究的热点主要集中在荧光材料标记物、纳米金、纳米银、氧化硅纳米颗粒等纳米材料的制备与应用上，各种各样的纳米结构决定了它们在生物检测中的应用特性。

在纳米荧光标记材料的研究中，分子信标的研究是最新研究进展之一。所谓分子信标(molecular beacon)，是一种具有发夹结构的新型荧光核酸探针。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与猝灭基团靠得很近，荧光被猝灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，荧光恢复。近年来人们对这种具有诸多优良特性的寡核苷酸探针进行了大量的试验，对其结构特性以及在各方面的应用展开了广泛而深入的研究，做出了许多改进，使其在序列检测、病原体侦测、药物疗效监测、区分基因野生型和突变型、DNA-蛋白相互作用研究、定量聚合酶链扩增(PCR)、以及体外转录反应中的RNA实时检测等众多领域中得到应用。例如，可用分子信标对活细胞中mRNA进行监测，并应用于DNA/RNA超小生物传感器及蛋白质实时检测。随着生物纳米技术的发展，最近杜贝垂(Dubertret)等尝试用1.4nm的纳米金作为猝灭基团。与常规猝灭基团DABCYL相比，纳米金可以在可见到近红外的波长范围内，有效的猝灭各种荧光染料。而且金颗粒在较低的离子强度条件下吸收效果较好。纳米金的引入，不仅可以降低分子信标制备成本，而且研究结果表明，这种技术对单碱基错配序列更为敏感，特别适合于在众多相似序列中高灵敏地检测出靶序列。例如，可在竞争性杂交阵列中高灵敏地检测出单碱基突变。目前的问题是需要进一步改善纳米金与DNA之间结合的稳定性，以免消除分子信标过程中纳米金掉下而影响猝灭效果。