[发明专利]基于环状介导等温扩增技术的基因快速诊断方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体地说，用基于环状介导等温扩增基因技术的体外生物检测试剂快速检测病原微生物的一种技术。

背景技术

目前对致病微生物有多种检测方法，从以病原微生物分离培养、形态学鉴定和自动生化鉴定为主的国家标准(GB/T 4789-2003)，到特异蛋白的免疫学检测技术、核酸探针、聚合酶链式反应(PCR)技术等分子生物学检测方法[陈福生等：食品安全检测与现代生物技术，化学工业出版社，2004年]。其中病原核酸检测在快速性、安全性、准确性和灵敏性等方面都有很大的提高，这些新技术试图突破传统的形态学、生化反应等微生物学检测旧模式，不需要对微生物进行分离培养，而直接用样品或样品的增菌液对其基因及基因产物进行快速检测，并且与分子生物学技术及生物信息学手段相结合，向准确、快速、灵敏和自动化的方向发展。

以聚合酶链式反应(简称PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此，不适用于现场快速检测；而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，及时将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。其中，等温扩增(Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification of DNA，简称LAMP技术)在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T， Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA，Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12)：E63.。该方法通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是1.其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。

发明内容

本发明的目的在于建立一种特异性强、灵敏度高、检准率高的环状介导等温扩增基因技术检测病原微生物的方法，广泛应用于食品、药品、医疗卫生等领域的检测。

为达到本发明的目的所采用的技术方案为一种环介导等温扩增基因快速诊断方法，包括如下步骤：

一、对被检样品的预处理：用常规法快速提取DNA或快速提取RNA；

二、特异性引物制备：包括目标靶基因数据库的建立；生物信息学的分析比较；基因组多态性的分型处理和简并碱基的运用，从而获得所需各种靶基因的特异性引物两对，为内引物和外引物各一对，经DNA合成仪生成寡聚脱氧核苷酸引物，且分别与靶基因中的六个独立区域序列特异性匹配；

三、进行环介导等温扩增反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与Bst DNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应。

四、分析判断反应产物结果：在反应产物中加入荧光染料如市面销售的荧光染料(SYBR GREEN I)，混匀，静置5min，反应产物显现绿色则为阳性，显橙色则为阴性。

本发明所提供的环介导等温扩增技术的基因快速诊断方法，有以下创新点：

1.特殊引物的设计：原有LAMP的引物设计上条件非常苛刻，本发明运用生物信息平台进行大规模基因组分析，引入简并碱基和基因组分型处理，使引物设计更加完善。