[发明专利]一种分离和纯化重组腺相关病毒载体的方法

说明书

所属技术领域

本发明涉及一种用于分离和纯化重组腺相关病毒载体的方法。

背景技术

传统的分离和纯化重组腺相关病毒载体的方法是采用硫酸铵分步盐析法将重组腺相关病毒与细胞碎片分离并使之浓缩，然后用氯化铯梯度超速离心48小时，获得重组腺相关病毒组分。这种方法费时费力回收率低，同时重组腺相关病毒的感染性也有较大的损失，而且，氯化铯对人体具有潜在的毒性。由于肝素是重组腺相关病毒天然受体的类似物，近年来有报道肝素亲和层析的纯化方法。采用这种纯化方法的潜在问题是很多细胞蛋白质也同肝素结合，因此需要解决如何去除杂蛋白的问题.Zolotukhin等人采取了先用碘狄醇密度梯度离心，得到“半纯化”的重组腺相关病毒，再用肝素亲和层析进行纯化。尽管这些方法使重组腺相关病毒的回收率有较大提高，但亦有成本高，仪器设备要求高等缺点，不易推广。因此，目前仍然缺乏一种高效，简便，低成本的重组腺相关病毒载体纯化方法。

发明内容

本发明的目的是为了克服已有技术的缺点，提供一种简便，高效，低成本的分离和纯化重组腺相关病毒载体的方法。氯仿处理裂解细胞，加入1/10细胞悬液体积的氯仿，37℃摇床中剧烈振摇1小时。1mol/L NaCl/10％PEG对腺相关病毒进行浓缩。氯仿抽提除去残留的PEG及蛋白质，振摇溶解后冰浴放置1小时。透析去除病毒液中残留的无机盐，将病毒液至于2LPBS溶液中，4℃过夜。将病毒液用旋转蒸发仪4℃蒸发2小时，去除残留的微量氯仿。浓缩柱浓缩病毒液，3000转/分离心，浓缩为500μL，提高病毒的滴度。

本发明有如下优点：不仅能够得到较高纯度和滴度的重组腺相关病毒载体，而且方法简便，成本较低，病毒颗粒的活性不受影响，对人体无毒性。

具体实施方式

〔1〕收集重组腺相关病毒载体的包装细胞，悬浮于PBS溶液中。加入1/10体积的氯仿，置于37℃摇床中剧烈振摇1小时。加入固体氯化钠至终浓度1mol/L，振摇溶解，4℃，12000转/分离心15分钟。取出上层水相，弃去氯仿和沉淀。

〔2〕加PEG8000至终浓度10％(w/v)，振摇溶解后冰浴放置1小时，11000转/分离心15分钟。将上清弃去，用5mL PBS缓冲液将各离心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脱下来合并，将其分装至1.5mL塑料离心管中(0.6mL/管)，加入DNA酶和RNA酶至终浓度1μg/mL，室温下消化30min。

〔3〕加等体积的氯仿抽提，4℃，12000转/分离心5分钟。

〔4〕小心吸出上层水相至透析带中，至于2LPBS溶液中，4℃过夜。

〔5〕再移至1.5mL塑料离心管中，置于旋转蒸发仪上，4℃旋转蒸发2小时，

〔6〕然后将病毒液装入Millpore浓缩柱中，3000转/分离心，浓缩为500μL，即为纯化的病毒液。

用此方法获得的腺相关病毒滴度可达1.0×10¹²病毒颗粒/ml，用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测可见明显的代表病毒外壳的VP1，VP2，VP3三种蛋白条带。