[发明专利]突变的SHV型β－内酰胺酶、其基因序列及应用

说明书

技术领域

本发明涉及细菌β-内酰胺酶的突变，尤其涉及一种突变的SHV型β-内酰胺酶，其基因序列及应用。

背景技术

自1929年青霉素发明以来，抗生素在防治细菌性疾病方面，发挥了巨大的作用。但是，由于抗生素的长期大量使用，特别是不规范地滥用抗生素，导致了日益严重的细菌耐药性问题。细菌耐药最主要的机制是产生灭活酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等。β-内酰胺酶能够与β-内酰胺环的羧基共价结合，使其酰胺键水解，灭活青霉素和/或头孢菌素。β-内酰胺酶种类较为复杂，到目前已发现有三百多种，并且由于超广谱β-内酰胺类抗生素的大量使用，出现了耐受超广谱β-内酰胺类抗生素的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)。

根据末端氨基酸序列及编码基因的位点可将β-内酰胺酶分成A、B、C和D四类：SHV属于A类，金属酶属于B类，AmpC酶属于C类，OXA型酶是D类(Paterson DL，KoWC，Von Gottberg A，et al.International prospective study of Klebsiellapneumoniae bacteremia：implications of extended-spectrum beta-lactamaseproduction in nosocomial Infections.Ann Intern Med.2004 Jan 6；140(1)：I143)；其中最有影响的酶是头孢菌素酶、耐酶抑制剂的TEM型、SHV型酶和金属酶。

β-内酰胺酶广泛存在于各种细菌中，至今已鉴定出了64种β-内酰胺酶SHV变异体(http:∥www.lahey.org/studies/)。这些SHV变异体是SHV基因突变所致。已公布的SHV基因突变目前至少有49个。其中L35Q、G238S和E240K这三个突变最为常见，并与绝大多数的SHV型ESBLs相关。突变G238S通常介导非ESBL型SHV转换成ESBL，而突变E240K进一步提高ESBL的酶活性，扩大β-内酰胺类抗生素耐药谱(Hammond DS，Schooneveldt JS，Nimmo GR，Huygens F，Giffard PM.bla(SHV)Genesin Klebsiella pneumoniae：different allele distributions are associated withdifferent promoters within individual isolates.Antimicrob Agents Chemother.2005，49：256-263)。

SHV型ESBLs有水解头孢噻吩的巯基作用，SHV是巯基变量(sulphydrylvariable)的缩写，它是在广谱酶SHV-1型基因序列的基础上由一至数十个氨基酸的密码子突变而成，多数分子量为29kD；呈弱碱性，pI为7.0～8.2；均由质粒介导。第238和240位氨基酸的变化是影响酶水解能力的主要位点，其中第238位由甘氨酸变成丝氨酸可增加对头孢噻肟的水解能力，而第240位的谷氨酰胺变成赖氨酸可增加对头孢他啶的水解能力。SHV型ESBLs主要发现于肺炎克雷伯菌中，在差异枸橼酸杆菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌中也有发现。

SHV-2是第一个被发现的ESBLs，与SHV-1相比，仅发生了1个氨基酸的改变(238Gly→Ser)，并对第三代头孢菌素有水解作用(Heritage J，M’Zali FH，Gascoyne-Binzi D，Hawkey PM.Evolution and spread of SHV extended-spectrumβ-lactamases in gram-negative bacteria. J Antimicrob Chemother.1999；44：309-318)。早期发现的SHV型衍生酶，主要存在于肺炎克雷伯菌中；1997年在美国首次报道了产SHV-7的大肠埃希菌。同年，瑞士首次发现产SHV-11和SHV-12的肺炎克雷伯菌(Nüesch-Inderbinen MT，Kayser FH，Hchler H.Survey andmolecular genetics of SHV β-lactamases in Enterobacteriaceae in Switzerland：two novel enzymes，SHV-11 and SHV-12.Antimicrob Agents Chemother.1997；41：943-949)。