[发明专利]一种血红蛋白凝胶层析的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种血红蛋白的分离纯化方法，特别涉及一种血红蛋白凝胶层析的方法，属于化学领域。

背景技术

凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusionchromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物-交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析(流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析)。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。

发明内容

本发明的发明目的旨在提供一种血红蛋白凝胶层析的方法。

本发明的目的可通过以下技术实现。

一种血红蛋白凝胶层析的方法，其步骤为：

1.凝胶的处理：取葡聚糖凝胶(Sephadex-25)干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀，然后倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，最后加入等体积pH7磷酸缓冲液继续浸泡；

2.装柱：将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入缓冲液，把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边到入柱中，同时开启止水螺丝，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中；

3.平衡：用磷酸缓冲液洗脱，平衡20分钟。

4.血红蛋白样品的制备：取若干抗凝血于烧杯中，加入磷酸缓冲液，再加入固体铁氰化钾，使浓度达到5mg/ml。

5.层析柱还原层的形成：取适量FeSO₄于小烧杯中，加入适量Na₂HPO₄,80mMNa₂H₂EDTA混合液搅拌均匀。待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，速取适量该混合液加入层析柱中，待混合液完全进入柱床后加入适量缓冲液；

6.上样：将柱中多余的液体从底部流出后关闭止水螺丝，取前面制备好的血红蛋白样品适量，将样品溶液小心加到凝胶柱上，打开止水螺丝，使样品溶液流入柱内；

7.洗脱：用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每5秒一滴的流速，观察并记录实验现象。

8.清洗：待所有色带流出层析柱后，加快流速，继续清洗层析柱5min。

所述的步骤3中，液面高于低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。

下面通过本发明的实验结果来说明本发明方法的应用效果。在层析柱中加入含有亚铁离子的溶液，形成一个还原区带；当红褐色的血红蛋白样品(血红蛋白与铁氰化钾的混合液)流经还原区带时，褐色的高铁血红蛋白与亚铁离子结合生成紫色的还原型血红蛋白；还原型血红蛋白继续下移，与缓冲液中的氧分子结合又形成了鲜红的氧化型氧合血红蛋白；亚铁氰化钾则因分子量小，在层析柱中呈现其本来的黄色条带而远远地落在血红蛋白的后边。

本发明的有益效果为：提供了一种血红蛋白凝胶层析的方法，具有方便使血红蛋白分离纯化的优点。

具体实施方式

实施例：

1.凝胶的处理取3克葡聚糖凝胶(Sephadex-25)干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀(室温，6小时)，然后倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，最后加入等体积pH7磷酸缓冲液继续浸泡。

2.装柱将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5-7cm高的缓冲液，把溶胀好的糊状凝胶边搅拌边到入柱中，同时开启止水螺丝，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。最好一次连续装完，若分次装入，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面。装柱长度至少8cm。最后放入略小于层析柱内径的滤纸片，以防将来加样时凝胶被冲起。

3.平衡用磷酸缓冲液洗脱，平衡20分钟。注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。