[发明专利]一种L－山梨糖脱氢酶及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域中一种L-山梨糖脱氢酶(SDH)、其编码基因、表达方法与应用。

背景技术

目前已知多种微生物可以将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)，而2-KGA是维生素C生产的重要中间体，一些报道用微生物细胞裂解液将L-山梨糖转化为L-山梨酮。如美国专利3912592中报道氧化葡萄糖酸菌，假单孢菌，ACINETOBACTER杆菌，八叠球菌，链霉菌，SERRATIA，气杆菌，分支杆菌及拟青霉菌都有这样的转化特性。最早由Makover等(biotechnol bioeng171485-1514，1975)描述了假单孢菌PUTIDA ATCC 21812中的酶的特性，但未分离纯化。KITAMURA等(biotechnol bioeng 17349-359，1975)报告了氧化葡萄糖酸菌(IFO3293)中SDH活性被PMS(phenazine methosulfate)、亚甲基蓝或钾铁氰化物等电子受体激活，但同样也未分离到此酶。在美国专利4916069(FUJIWARA等)从氧化葡萄糖酸菌中分离到SDH为膜结合蛋白，分子量约为58000，为单个分子，在辅酶存在下能氧化L-山梨糖至L-山梨酮，具有底物专一性。美国专利5753481(后续申请5861292，6197562)(NIWA等)由氧化葡萄糖酸菌T-100膜蛋白中分离到SDH及其基因，其分子量为58000，N端氨基酸序列为THR-SER-GLY-PHE-ASP-TYR-ILE-VAL-VAL-GLY-GLY-GLY-SER-ALA-。用E.COLI表达该基因得到的产物具有转化活性。在美国专利5437989(ASAKURA等)中称在氧化葡萄糖酸菌DSM4025FERM BP-3812分离到与乙醇/醛脱氢酶同源的酶，在电子受体存在下，能将L-山梨糖转化为2-KGA。该酶分子量为130000/140000(凝胶过滤法测定)，由两个分子量分别为62,500-66,500daltons和60,500---64,500daltons的不同亚基组成。在文章“L-山梨糖脱氢酶的纯化及性质研究”(薛震役等)(《微生物学通报》2000年27(2))对氧化葡萄糖酸菌SCB329中的SDH进行了提纯，但即未进行蛋白组成分析，也没有进行L-山梨糖到L-山梨酮或L-KGA的转化实验。

发明创造内容

本发明的目的之一在于提供一种新的编码L-山梨糖脱氢酶的基因；

本发明的另一个目的在于提供上述基因编码的多肽；

本发明的另外一个目的在于提供上述序列的表达载体；

本发明的最后一个目的在于提供上述基因的用途。

根据本发明的一个方面，编码L-山梨糖脱氢酶的基因是从酮古龙酸菌(Ketogulonigenium sp.)WB0104(CCTCC No.M203094)中分离得到的(SEQ IDNO：1)，该基因的ORF长为1737，编码579个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：5)与所有已知基因氨基酸水平同源性最高为来源于Pseudogluconobactersaccharoketogenes  的乙醇脱氢酶，同源性为53％。SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8的同源性分别为68％，67％，67％。

具体地说，本发明提供了新的分离的多核苷酸，其含有下述序列之一：

(1)序列表中的SEQ ID No：1所示的序列；

(2)编码序列表中SEQ ID No：5所示蛋白质序列的多核苷酸序列。

上述涉及的多核苷酸还包括取代、缺失、和插入变体以及等位变体、剪接变体、片段、衍生物等，其中可以通过取代、缺失、插入或衍生一个或多个核苷酸。优选的这些多核苷酸是那些编码具有生物学活性的SDH的多核苷酸。

本领域技术人员可以理解的是，上述的分离的多核苷酸也包括那些与SEQID NO.1所示序列具有较高同源性的序列，例如同源性大于90％、甚至95％、甚至98％的序列；还包括那些在严谨条件下可与SEQ ID NO.1所示序列杂交的序列；或者可与上述序列互补的序列。