[发明专利]制备胰岛素缀合物的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种制备式胰岛素-低聚物的胰岛素-低聚物缀合物的方法。该方法涉及式为G-A-V-R-[B-链]-R-DA-D-D-R-[A-链]的前体IP-F的克隆和表达，并将该表达的生物合成的前体与激活的低聚物缀合，随后用蛋白酶处理，并纯化以得到活性胰岛素-低聚物缀合物。

发明背景

胰岛β细胞分泌胰岛素的单链前体，称为胰岛素原，其经蛋白酶解后，导致形成具有生物活性的多肽胰岛素。该胰岛素分子在各物种中高度保守，且通常由两个经二硫键连接的氨基酸链组成。天然的人胰岛素分子(mw5,807道尔顿)具有A链和B链，A链具有21个氨基酸残基，甘氨酸位于氨基末端；B链具有30个氨基酸残基，苯丙氨酸位于氨基末端。胰岛素可以作为单体存在或者聚集成二聚体，或由三个二聚体形成的六聚体。单体能够结合受体，且是生物活性形式。

胰岛素多肽是负责控制葡萄糖在身体内转运、利用和存储的主要激素。胰岛素产生不足或受体对胰岛素的敏感性降低造成的碳水化合物代谢缺陷导致生物学病症糖尿病。糖尿病损害了利用葡萄糖的正常能力，结果提高血糖水平(高血糖症)。当葡萄糖在血液中积累时，尿中排泄过度水平的糖(糖尿)。糖尿病的其他症状包括尿量和频率增加、口渴、搔痒、饥饿、体重减轻和虚弱。糖尿病若不经治疗则导致酮病，随后是伴有恶心和呕吐的酸中毒。随着有害产物继续累积，患者会陷入糖尿病性昏迷，其导致患者死亡。有两种类型的糖尿病。I型是胰岛素依赖性糖尿病或IDDM。IDDM从前被称为“青少年糖尿病”。在IDDM中，胰不分泌胰岛素，且必须从外部来源提供胰岛素。尽管在一些晚期病例中需要胰岛素，但是II型或成年型糖尿病通常可通过饮食进行控制。

传统上几乎独有地使用牛和猪的胰岛素治疗人类糖尿病。随着重组技术的发展，可能通过发酵来商业规模生产人类胰岛素。另外，还开发了与天然人类胰岛素生物活性相当的基因工程改造的胰岛素类似物，以抗击糖尿病。但是，糖尿病的治疗方法通常需要定期注射胰岛素。由于胰岛素注射会不方便，因此已经尝试了各种方法以将胰岛素配制成通过非注射途径施用。这些公开物的名单包括：US4,338,306(Kitao等)报道了胰岛素和具有8-14个碳原子的脂肪酸及其无毒盐的药物组合物，用于胰岛素的直肠施用；US4,579,730(Kidron等)报道了一种含有胆汁酸或其碱金属盐的用于胰岛素经口施用的肠衣(enterocoated)胰岛素组合物；US5,283,236(Chiou等)报道了胰岛素组合物，其具有渗透增强剂以有助于较高分子量多肽的全身吸收，以及肽酶抑制剂用于通过眼全身送递胰岛素，其中该药物进入鼻泪管且被吸收到循环中；US5,658,878(Backstrom等)报道了胰岛素和碳链长度为10(即癸酸钠)、12(月桂酸钠)或14(肉豆蔻酸钠)的饱和脂肪酸的钠盐，其能增强胰岛素在下呼吸道中的吸收；US5,853,748(New等)报道了一种胰岛素、胆汁盐或胆汁酸和碳酸盐或碳酸氢盐离子的包有肠溶衣的组合物，用于调节消化道的pH为pH7.5到9以用于经口施用胰岛素。US6,200,602(Watts等)报道了胰岛素与吸收促进剂的用于结肠送递的胰岛素药物送递组合物，所述吸收促进剂包含连同分散剂一起的具有6到16个碳原子的脂肪酸和其盐的混合物，或中链脂肪酸的甘油单酯/甘油二酯的混合物，包在包衣中以防止该片剂、胶囊或丸剂到达近侧结肠前胰岛素和吸收促进剂的释放。

从文献中可以发现几种通过经口施用递送胰岛素方面做出的努力。在糖尿病患者中，与经口施用胰岛素以达到正常血糖相关的问题在药品以及医学文献中有很好的引证。胃肠道中的消化酶迅速降解胰岛素，从而导致产生生物学分解的产物。例如在胃内，经口施用的胰岛素经历酶促蛋白酶解以及酸性降解。过度的蛋白酶解阻碍在肠中的存活。在腔(lumen)中，多种酶包括胃以及胰酶、外-和内-肽酶以及刷状缘肽酶阻塞胰岛素。既使胰岛素经受得住这些酶的攻击，但体内，在胰岛素到达其受体之前必须穿过的生物屏障可能限制胰岛素的经口施用。例如，胰岛素可能拥有低膜透性，从而限制了其经过腔进入血流的能力。

像胰岛素这种药学活性多肽已被与聚乙二醇的多分散混合物或含有聚乙二醇的聚合物的多分散混合物缀合，以提供药物-低聚物缀合物的多分散混合物；US4,179,337(Davis等)报道了缀合多肽，例如胰岛素与各种聚乙二醇，如由UnionCarbide提供的MPEG-1900和MPEG-5000。US5,567,422(Greenwald)报道了生物学活性亲核体与聚乙二醇如m-PEG-OH(UnionCarbide)的缀合，其具有5,000道尔顿的数均分子量。