[发明专利]用于检测核酸的探针

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测核酸的探针，涉及制备所述探针的方法，涉及用于进行检测反应的方法，和涉及测试试剂盒，其包含用于进行基于探针的检测反应所需要的试剂。

背景技术

核酸的检测具有广泛的应用领域，例如人类或者兽医诊断学、食品领域、环境分析、作物保护、生物化学或者药理学研究和法医学中。

根据现有技术，核酸或者通过多相测定法或者通过均相测定法进行检测。多相测定法是需要至少一个洗涤步骤以使探针彼此之间的结合和非结合得到分离的方法。多相测定法如下进行，例如，将探针固定在固体相上，同时在溶液中对核酸进行检测。通过多相测定法检测核酸的实例是混杂过滤或者DNA微排列(参见，例如，M.L.M.Anderson，NucleicAcid Hybridization，Springer-Verlag，New York，1998或者D.Bowtell，J.Sambrook，DNA Microarrays，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2003)。多相测定的优点是其具有同时检测多种分析物的固有能力(多路复用)，缺点是，例如，需要洗涤步骤。均相测定的特征在于所有组分在溶液中相互反应，其中完全排除了洗涤步骤。在使用比较简单的装置时，通常可以选择利用均相测定的方法，但是其多路复用能力通常有限。无需洗涤步骤有利于自动操作，降低了受污染的风险并且使得检测反应以划算的方式进行。

用于检测DNA的探针通常由杂化和信号单元组成。杂化单元将序列明确连接在DNA靶上，并且由，例如，DNA、PNA或者其它DNA类似物组成。信号单元可以为，例如，放射性标记的微米或者纳米颗粒、氧化还原活性分子、发光或者荧光分子。信号单元通常共价连接在杂化单元上。为了防止信号单元干扰杂化，所述杂化单元通常连接在探针的5′或者3′末端的信号单元上。多相测定期间利用洗涤步骤分离连接在欲检测的核酸上的探针和在溶液中处于游离状态的探针，均相测定必须保证信号单元在探针的杂化状态中具有与游离状态中不同的性能。探针杂化后信号单元的改变可以通过，例如，荧光共振能量传递(FRET)或者通过DNA-插入分子得到实现。荧光的实例，根据FRET原理操作的均相探针是TaqMan^探针(PM.Holland等人，Proc.Natl.Acad.USA，1991，88，7276-7280)或者所谓的“分子信标”(WO 95/13399A1；S.Tyagi和F.Kramer，Nature Biotechnol.1996，14，303-307)。根据FRET原理工作的探针在它们的末端包含荧光基团和猝灭剂，由此荧光可以得到开关，可以说这取决于杂化状态。在分子信标的情形中，使用的探针是末端连接在荧光基团和猝灭剂上的DNA发夹结构。在没有杂化至靶体上的状态中，由于接近猝灭剂，因此荧光作用受到了抑制。在连接靶体的情形中，荧光基团和猝灭剂被空间分离，从而产生了与靶体增加量相关的强度升高的荧光信号。在PCR反应中，为了定量在各个周期中产生的产品的量，可以使用分子信标作为探针。根据现有技术，定量PCR(qPCR)是研究实验室和诊断学中检测和定量核酸的一种最常规方法。分子信标的缺点是它们具有限制其敏感性的固有荧光作用，这限制了辨别互补和单基失配靶体之间和可以使用所述探针内的非常狭窄的温度窗口之间的特异性。连接特异性和敏感性是开发杂化探针中的核心挑战，它们特别是对于检测单元突变(SNP)是至关重要的。