[发明专利]用于液相色谱的组合柱以及相关系统和方法

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求以2004年12月8日提交的美国临时申请No.60/634,128 作为优先权基础，该临时申请的全部内容以援引的方式纳入本文。

技术领域

本发明涉及液相色谱，更具体而言涉及用于液相色谱的组合柱 (integrated column)，含有组合柱的系统，以及使用组合柱的方法。

背景技术

在液相色谱系统或全溶液液相色谱系统中，液相色谱(LC)柱位于 进样器和检测器之间，用于将一种或多种目的成分从待分析样品中的各 种干扰物中分离出来，并使得检测器可以对这些成分进行检测。液相色 谱系统中的常用质量检测器可以按照样品组分的每单位时间或每单位体 积的质量来测量和提供结果。由这种输出信号可以提供“色谱图”。操作 者可使用色谱图来准确地识别和定量分析样品中存在的化学组分。

目前色谱学的趋势是使用高效和微型的液相色谱柱。最近对于微型 化的强烈需求的理由是微型化液相色谱柱所消耗的溶剂量极低，用于分 析所需的样品体积也显著降低，因此就可以在样品量有限时提供高效、 灵敏的分离。在液相色谱学中，使用填充有微颗粒的直径很窄的柱可获 得高分离度。填充有微型化微颗粒的液相色谱柱通常是通过将例如键合 二氧化硅颗粒的分离介质均匀地填充到窄直径的管中而制备的，这种分 离介质也被称为填料或固定相。

通常用来制备微型化分析柱的材料包括：聚合物、玻璃、金属、烧 结二氧化硅(fused silica)及其亚类聚合物涂敷的烧结二氧化硅和聚 合物包裹的烧结二氧化硅。代表性材料通常包括不锈钢和玻璃衬里的不 锈钢。

微型化液相色谱柱包括小孔柱、微孔柱和毛细管柱。这些柱通常的 长度为约5mm至300mm之间，但在有些情况下它们的长度也可能达到 最长为5000mm。小孔柱通常的内径为约2mm，而微孔柱的直径为约1mm。 烧结二氧化硅柱和其他毛细管柱的内径通常小于1mm，经常还小于0.1 mm。实际上，具有0.075mm内径的毛细管柱几乎成为了用于液相色谱质 谱的标准品。烧结二氧化硅毛细管柱可以承受例如9000psi或更高的高 填充压。

在蛋白质组学领域中，已经将填充有反相材料的二氧化硅毛细管用 于蛋白质/肽的HPLC-MS/MS分析。该方法使用了连接有质量检测器的高 效液相色谱(HPLC)系统。HPLC可分离上千种蛋白质/肽，然后通过串联 质谱进行表征。通过将质谱/质谱(MS/MS)谱图与理论上的谱图进行匹 配而识别肽序列。通过将肽序列与来自基因组学或蛋白质组学数据库的 预计片段进行匹配而识别蛋白质序列。

虽然一维反相(RP)HPLC加上质量分析是用于蛋白质/肽分析的有力 工具，但是该方法却受到一根柱上能负载和分离的肽的数量以及质谱仪 能检测的肽的数量的固有限制。在复杂的样品中可能有几千种蛋白质。 为了提高HPLC分离的毛细管的分离能力而使用了二维HPLC技术，该技 术使用离子交换色谱和RP HPLC的组合，先用离子交换色谱根据肽的电 荷分离肽，再使用RP HPLC根据肽的疏水性分离肽。

一个实例是使用填充混合床喷头通过离子交换-反相分离来分离肽， 然后进行质量分析。John Yates报道了使用二维LC-MS/MS对酵母蛋白质 组进行的蛋白质组学分析。将肽混合物上样至离子交换柱上并用不同盐 浓度洗脱。通过反相梯度分离肽级分，然后用串联质谱仪进行分析。通 过这种方法利用数据库识别了几千种蛋白质。这一方法具有二维LC分离 的优势，但是在反相-串联质量分析前需要进行大量的洗涤以除去盐。填 充混合床也不够稳定，仅能用于几次注入。

另一个实例是使用分析性维度的强阳离子交换(SCX)柱与两个反相 柱联合，以分离蛋白质胰蛋白酶消化产物。复杂的样品可以在SCX柱上 预分级，收集并在反相柱上分离至最终的分离度，通过质谱仪检测和识 别。两个反相柱可以在同一时间分别用于上样/清洗和分离。这种系统是 用于分离复杂的蛋白质混合物的有力工具。但是，它需要两套HPLC泵、 两个反相HPLC柱以及用于操作该系统的复杂的软件。常规的一维HPLC 系统不能用于进行同样的分离。

因此，需要一种使用一维HPLC系统而且不需盐梯度的HPLC方法或 系统，来实现目前必须通过二维HPLC-MS/MS分析才能实现的蛋白质/肽 混合物的分离。

发明内容