[发明专利]胆固醇测定

说明书

本发明涉及区别样品混合物中不同类别脂质分子的测定系统。特别是，本发明涉及确定血浆或血清中胆固醇浓度的方法。本发明还涉及实施所述方法所用的装置。

脂质是活生物体中存在的有机化合物的一个多样组。它们在水中是不溶的，但是可溶于有机溶剂。将脂质广泛分类成两个类别：(i)复杂脂质；和(ii)简单脂质。复杂脂质是长链脂肪酸的酯并且包括甘油酯类、糖脂类、磷脂类、胆固醇酯类和蜡。不含有脂肪酸的简单脂质包括类固醇类(例如，胆固醇)和萜类。

脂质可以与蛋白质结合形成脂蛋白，其为这样的形成，即其中脂质，诸如胆固醇和甘油三酯在血液和淋巴中输送。为了简短，在这里使用术语“血清”，但是涉及“血清”应当解释为涉及血清或血浆。在血浆中发现的脂蛋白属于三个主要分类：(i)高密度脂蛋白(HDL)，(ii)低密度脂蛋白(LDL)，和(iii)非常低密度的脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。

胆固醇在血流中主要以LDLs形式输送，并且利用肝中的LDL受体从血液除去。将含有胆固醇的LDLs结合到LDL受体，然后将其摄入细胞。作为遗传缺陷发生在一些个体中的LDL受体缺乏，被认为是血液中高水平胆固醇的原因，使他们易于患动脉粥样硬化，即有害斑块在血管壁上的发展，其可以导致心脏病发作和中风。充分证明的是，在血浆中多种脂蛋白浓度和动脉粥样硬化风险之间存在有力的关系。同样已知，不同类别的脂蛋白(HDL、LDL和VLDL)在动脉粥样硬化中各自起不同的作用。例如，将HDL认为是抗致动脉粥样化的(antiatherogenic)，而已知LDL是高度致动脉粥样化的(它携带的胆固醇与动脉粥样硬化的发展密切相关)。VLDL被认为是轻微致动脉粥样硬化的，而且在女性中更显著。

因此多种脂质成分的每一种，特别是胆固醇，在血液中的相对浓度的知识，将是有利的，因为这将在治疗具有这些脂质的不适当血液浓度的患者中帮助临床医生。

已经开发了用于确定血液中一些脂质成分浓度的测定。这样的测定通常涉及首先从患者取血样，然后将其送到临床实验室用于分析。这样的测定不得不利用昂贵的装置和试剂进行，并且需要相当长的时间以产生结果。这耽搁治疗。而且，所述测试是复杂的并且因此是昂贵的。另外，在实验室中使用的装置不容易便携，并且因此不能由GPs或护士在出诊时使用，或者甚至作为家用测试试剂盒使用。因此，存在提供用于分析血液血清中脂质并且特别是胆固醇浓度的改进方法的需要。

Liebermann-Burchard(L-B)反应测定是测量血液中总胆固醇的众所周知方法，并且被认为是“金标准”。这是基于吸光度的测定，并且图1显示该Liebermann-Burchard反应的示意图。首先，制备由30％冰醋酸、60％乙酸酐和10％硫酸的溶液组成的L-B反应试剂。其次，然后将5ml该L-B试剂加入到0.2ml由血浆获得的样品，将其混合在一起然后进行放置20分钟。L-B反应通常在包含已经从血浆萃取到有机溶剂中的胆固醇样品上进行。L-B反应的产物是两个有色的产物。Liebermann-Burchard反应产物的典型吸光度光谱显示在图2中。然后利用分光光度计测量产物的吸光度，所述产物的浓度与胆固醇浓度相关。可以利用胆固醇标准物，从吸光度对胆固醇浓度的校正曲线确定胆固醇的总浓度(Burke等，Clin.Chem.20(7)，794-801(1974))。

然而，L-B反应测定的问题是它需要相对大量的试剂，这是一个明显的缺点，因为所述试剂是非常腐蚀性的并需要特殊关注。通常同样需要的是，将胆固醇从血浆萃取并且该萃取步骤构成测定中麻烦的额外步骤。因此，L-B反应测定在许多实验室中已经由酶联测定取代，因为在L-B反应测定中需要相当大量的样品数量并且使用腐蚀性试剂。然而，用于确定总胆固醇浓度的这样的酶-联测定的使用趋向于更容易和更安全地进行，但是不如L-B测定精确。因为产生的结果是不太精确的，所以临床医生将优选L-B反应测定准确度，特别是对于具有更高冠心病危险因素的个体确定治疗过程时。

因此，即使存在测定血液样品中胆固醇浓度的有效方法，也应当理解这些方法具有许多限制。

因此本发明实施方案的目的是排除或减轻现有技术的问题，并且提供用于测定取自受试者的样品中胆固醇浓度的改进方法。进一步的目的是提供用于实施所述方法的装置。

如上所述，常规的L-B反应测定测量吸光度，因此需要相对大体积的L-B反应试剂。例如，用于测量吸光度的比色杯趋向于保持约1ml的样品而起作用。应当理解，L-B试剂的成分是非常腐蚀性的，其因此在使用时需要特殊的关注。因此，对于测量血样中的胆固醇浓度，L-B测定由实验室技术人员使用是相当麻烦的。