[发明专利]嵌段酶－探针复合物

说明书

技术领域

本发明涉及用酶标记探针的技术。如此产生的嵌段酶-探针复合物广泛用于采用免疫反应的免疫检测，如酶免疫检测、免疫组化等。 

背景技术

在免疫学检测或测定方法中通常已广泛使用用酶标记探针的酶标探针。例如，用辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)、β-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶等标记的探针可用于免疫组化和酶免疫测定的检测步骤。 

免疫组化和酶免疫测定已经长期广泛用作在活体中检测自身抗原或外来抗原的方法。由于这些采用免疫反应的检测方法具有高特异性和灵敏度，可无需分离而检测体内的少量物质。然而，许多物质存在于体内的量非常少，以致于普通的免疫组化和酶免疫测定不能检测，已进行了一些研究以发现提高检测方法灵敏度的方法以检测这些物质。 

例如，健康人血清中肿瘤标记物如癌胚抗原(CEA)和甲胎蛋白的浓度为5-20ng/ml。然而，健康个体血清中人胃泌素释放肽前体(ProGRP)的浓度约为14pg/ml，需要高1000倍的灵敏度以检测ProGRP。此外，对于外来抗原，例如丙肝病毒，在血液中的量很小，因此需要高灵敏度的抗原检测方法。为了检测该抗原，需要可检测100-1000个拷贝的病毒RNA和约0.03-0.3pg/ml蛋白质浓度的灵敏度水平。 

为提高免疫检测方法的灵敏度以检测以这样的微量存在于体内的抗原或物质，已经进行了多种努力。Ishikawa等(非专利文献1)详细描述了对提高酶免疫检测灵敏度的研究。影响酶免疫检测灵敏度的因素包括检测系统类型、标记的检测灵敏度、标记方法的类型、免疫反应时间以及抗原和抗体间的亲和力。此外，影响用夹心法测定抗原的灵敏度提高的条件包括：抗体与固相连接的条件；抗原反应效率；酶标抗体的反应效率；标记抗体与固相的非特异性吸附的降低；标记抗体的添加量；免疫反应时间；温度、pH、离子强度和免疫反应缓冲液的选择；立体化学构型和抗原决定基团的数量。

除了上述研究以外，为了提高酶免疫检测的灵敏度，人们努力在检测步骤中在酶和抗体的交联方面改进标记方法。已知制备标记抗体的各种方法，具体地说，Ishikawa等报道的制备标记抗体的方法已经广泛应用于普通诊断试剂。在通常所述方法中，一至几个酶主要结合于抗体(在IgG的情况下，分子量约为150,000，在Fab’的情况下，分子量约为46,000)，例如其中三个辣根过氧化物酶(HRP)(分子量40,000)分子与一个IgG分子结合在一起的复合物的总分子量为40,000×3+150,000＝270,000。同时，其中三个碱性磷酸酶(ALP)分子(分子量100,000)与一个IgG分子结合在一起的复合物的总分子量为100,000×3+150,000＝450,000。然而，Ishikawa等的描述显示，优选通过以1个分子:1个分子的比例将抗体结合于酶，尤其是采用去除Fc部分后的Fab’部分，实现灵敏度最高的测定，并开发了一种将一个抗体分子共价连接于一个酶分子方法(非专利文件2)。在酶与抗体1:1结合的抗体酶标记法的情况下，例如共价连接的一个HRP分子和1个Fab’分子的复合物的总分子量为40,000+46,000＝86,000。通常，主要采用总分子量为200,000或更小的酶标记复合物。 

为了开发高灵敏度的免疫检测方法，以各种方式试验了通过增加步骤以增强信号。例如，采用生物素和抗生物素蛋白的高亲和力，主要将几个生物素分子引入第二抗体，生物素化的第二抗体与待分析物质反应后，去除过量的生物素化第二抗体。然后加入抗生物素蛋白-酶，形成生物素化第二抗体-抗生物素蛋白-酶复合物，并通过增加连接于第二抗体的酶分子数提高灵敏度。可以用抗生物素蛋白-生物素-酶复合物替代抗生物素蛋白-酶。同时，Butler等描述了作为过氧化物酶-抗过氧化物酶抗体的抗体-酶复合物(非专利文献3)。Bobrow等将过氧化物酶标记的第二抗体与待分析物质进行反应，并在去除过量过氧化物酶标记的第二抗体后，加入生物素-酪胺(tyramide)，使自由基化的生物素-酪胺与过氧化物酶标记的第二抗体周围的封闭蛋白结合，并在洗涤后用过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白放大酶信号(非专利文献4)。然而，这些方法都由缺点，如增加步骤数量和测定时间。