[发明专利]棒状细菌gnd基因的等位基因

说明书

本发明提供了棒状细菌(coryneformer Bakterien，coryneformbacteria)编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(EC：1.1.1.44)变体的gnd基因的突变体和等位基因，以及使用含有这些等位基因的细菌生产氨基酸、特别是L-赖氨酸和色氨酸的方法。 

现有技术

在人类医学、制药工业、食品工业以及特别在动物饲料中使用氨基酸。 

已知提供发酵棒状细菌菌株、特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)可以生产氨基酸。因为其重要性，一直在进行改良生产方法的工作。对于所述方法的改良可以涉及与发酵有关的参数，如搅拌和氧供应，或者涉及营养培养基的组成，如发酵过程中的糖浓度，或者涉及对产物进行加工，如离子交换层析或者涉及微生物自身的固有性质。 

为了改良这种微生物的性质，使用了诱变、选择和突变选择方法。这些方法产生了对抗代谢物有抗性或者对于调控而言是重要的代谢物是营养缺陷型的、并且生产氨基酸的菌株。已知的抗代谢物是赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)。 

多年来，重组DNA技术的方法已经用于通过扩增各个氨基酸生物合成基因以及研究对氨基酸生产的作用来改良棒杆菌属的L-氨基酸生产菌株。谷氨酸棒杆菌的遗传学、代谢和生物技术许多不同方面的总结可见于Pühler(主编)，Journal of Biotechnology 104(1-3)，1-338，2003。 

名为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)菌株ML-223(FERMBP-1497)的棒状细菌的编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因的核苷酸序列描述于JP-A-9-224662。谷氨酸棒杆菌的gnd基因的核苷酸序列可见于专利申请EP-A-1108790的序列No.1605、序列No.7063和序列No.7064。 

关于gnd基因的其它核苷酸序列被保藏于国立医学图书馆(Bethesda，MD，USA)的国立生物技术信息中心(NCBI)的数据库中，登录号为AX253243、AX121689、AX065125、AX065127、AX127147和AX127148。 

关于6-磷酸葡糖酸脱氢酶的重要性的生理学研究被如Sugimotoand Shiio(Agricultural and Biological Chemistry 51，1257-1263)和Moritz et al.(European Journal of Biochemistry 267，3442-3452(2000))所公开。 

专利申请WO 01/71012描述了使用棒状细菌菌株，gnd基因的过表达在促进不同氨基酸、如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-色氨酸的生产和制备中的作用。 

编码谷氨酸棒杆菌的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的核苷酸序列被保藏于日本的DNA数据库中(DDBJ，Mishima，Japanhttp://gib.genes.nig.ac.jp/single/index.php？spid＝Cglu_ATCC13032)，基因名称为Cgl1452。编码区位于所述基因组序列的相反链(gegenstrang)的第1530338位核苷酸至1531816位核苷酸。国立生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的数据库也可用于定位所述核苷酸序列。登录号AX127148中，在所述核苷酸序列的相反链的第30341位核苷酸至31816位核苷酸发现了6-磷酸葡糖酸脱氢酶的编码区。 

为了清楚，根据DDJB和NCBI数据库的说明，编码谷氨酸棒杆菌的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因(“野生型基因”)的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，所编码的6-磷酸葡糖酸脱氢酶的氨基酸序 列示于SEQ ID NO：2和4。SEQ ID NO：3示出位于上游和下游的核苷酸序列。 

发明目的 

本发明的目的是提供用于改良生产氨基酸、特别是L-赖氨酸和L-色氨酸的新的措施。 

发明描述 

本发明提供了产生的或分离的、优选分泌氨基酸并含有编码具有6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性的多肽的基因或等位基因的棒状细菌的突变株，其特征在于所述多肽包含在329位或氨基酸序列的相应或相当位置存在除了L-缬氨酸以外的任何蛋白质氨基酸的氨基酸序列。优选用L-甲硫氨酸置换L-缬氨酸。