[发明专利]环糊精的检测和定量

说明书

技术领域

本发明涉及在含蛋白质的溶液中的环糊精以及环糊精衍生物的检测和定量。本发明进一步涉及评估药物制剂中的残留环糊精的存在的方法。

背景技术

环糊精是一种环状多糖，通常多由六个(α-环糊精)、七个(β-环糊精)或八个(γ-环糊精)葡萄糖单元组成，这些葡萄糖单元由α-1，4-葡萄糖苷键连接为环状的环。这些葡萄糖单元形成椅式构象后，所有的仲羟基位于该环的一侧，而所有的伯羟基基团均位于另一侧。其结果是，其外部表面是亲水的，从而使环糊精可水溶解。相反，环糊精的空腔是疏水的，因为它们由C₃和C₅原子的氢以及醚样氧连接。这种结构允许环糊精与疏水化合物形成包合物(inclusion complex)。基于该特性，环糊精广泛地用于提高难水溶药物的水溶性，加强药物稳定性，并降低药物的不期望出现的负作用。

该环糊精的羟基基团可以衍生，以改变分子的特性(例如：水溶性、结合特性)。甲基-β-环糊精(MBCD)是其中一种最常使用的环糊精衍生物。

环糊精也应用在细胞培养系统中以将疏水营养物，例如胆固醇，转运入细胞中。环糊精对培养胆固醇营养缺陷型细胞特别有用，例如胆固醇营养缺陷型CHO细胞、COS细胞以及NSO细胞。当细胞培养被用来制备自然产生的蛋白质或重组蛋白质、特别是药用蛋白质时，在纯化的蛋白质产品中作为残留的污染物存在的环糊精在药物制备中成为一个问题。因此，需要一种灵敏和快速的技术，以检测和定量含蛋白质溶液中的低水平的环糊精或环糊精衍生物。

Grosse等人(J.Chromatography B 694：219(1997))披露了一种用于检测MBCD的技术，该技术利用尺寸排除色谱法，并采用一种可与MBCD形成包合物的荧光团(1-萘酚)，从而允许对该包合物的荧光检测。该技术被设计为用来检测血浆样本中的MBCD，以用作药物动力学研究，其需要在运用色谱法之前，在流动相中利用有机溶剂萃取样本，蒸发和溶解残留物。Gage等人(J.Pharm.Biomed.Analysis 22：773(2000))披露了一种利用1-萘酚，用于测量在血浆样本中的硫代丁基醚-β-环糊精的类似技术。该方法需要在运用色谱法之前处理样本，包括固相萃取、蒸发、以及溶解残留物。这些技术不能达到从蛋白质组合物中分离环糊精的效果。

在本技术领域中，需要一种用于检测蛋白质中环糊精或环糊精衍生物的存在的方法，优选地不需要样本萃取步骤。

发明内容

因此，在一个方面，本发明提供了一种用于检测在含蛋白质溶液中的环糊精或环糊精衍生物的存在的方法，该方法包括通过尺寸排除色谱法(SEC)从所述蛋白质中分离可能存在的任何环糊精或环糊精衍生物，将所述环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物，以及测量来自于所述包合物的信号的存在。

本发明的另一个方面，为一种用于确定在含蛋白质溶液中可能存在的环糊精或环糊精衍生物的量的方法，该方法包括通过SEC从所述蛋白质分离任何环糊精或环糊精衍生物，将所述环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物，测量来自于所述包合物的信号的存在，以及确定所述信号的大小，其中该信号的大小指示在该溶液中的环糊精或环糊精衍生物的量。

本发明的第三个方面，是一种评估药物制剂的方法，该方法包括：

(a)提供一种包括药用蛋白质和药学上可接受的载体的药物制剂；

(b)利用SEC分离所述药物制剂；

(c)将可能存在于所述药物制剂中的环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物；以及

(d)检测来自于所述包合物的信号，其中该信号的大小指示在该制剂中的环糊精或环糊精衍生物的量。

在本发明的一个实施方式中，该环糊精或环糊精衍生物为MBCD。

在本发明的另一个实施方式中，该制剂为一种荧光团，例如，1-萘酚。该制剂可在由SEC进行分离之前、该分离期间或者分离后与该环糊精或该环糊精衍生物相接触。

在一个实施方式中，该溶液或药物制剂的样本可不作任何准备地被装载于该SEC柱上，例如，该样本不需利用有机溶剂进行萃取、干燥、再悬浮、浓缩或其它改变。

附图说明