[发明专利]新型高碱性蛋白酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及在洗涤剂等高碱性条件下也具有优异活性的新型碱性蛋白酶、编码该碱性蛋白酶的氨基酸序列的基因和该碱性蛋白酶的制造方法。 

背景技术

蛋白酶是催化肽键水解的酶群的总称，广泛分布于微生物、动物和植物中。作为其应用范围，有以洗衣用洗涤剂为首的厨房用洗涤剂、自动洗碗机用洗涤剂、隐形眼镜洗涤剂等各种洗涤剂；沐浴剂、用于去除角质等的化妆品；用于面包的制作、肉的软化、水产加工等方面的食品改良剂；助消化剂或消炎剂，在很多领域中广泛使用。 

如此地，蛋白酶在众多的酶中最大量地进行工业生产且其市场规模很大，其中洗涤剂用的碱性蛋白酶作为提高洗净能力中不可缺少的成分而起到重要的作用。作为这种碱性蛋白酶，在具体进行市售的市售品的商品名中，已知有例如サビナ一ゼ(Sabinase)、カンナ一ゼ(Kannase)、デユラザイム(Durazyme)(Novozymes公司生产)、マキサカル(Genencor公司生产)、ブラツプ(Henkel公司生产)(以上商品名均为注册商标)和KAP(花王公司生产)等。 

这种现在使用的洗涤剂用碱性蛋白酶源自杆菌(Bacillus)属细菌，属于被分类在Class I-S2中的枯草杆菌蛋白酶族(参照非专利文献1)。并且，作为真性枯草杆菌蛋白酶，熟知的是被分类在Class I-S1中的枯草杆菌蛋白酶BPN’和Carlsberg等。 

关于这些洗涤剂用蛋白酶，人们尝试寻找性能进一步得到了提高的洗涤剂用酶，并报告出对热和表面活性剂具有较高稳定性的酶(例如参照专利文献1)、作用于角蛋白等不溶性蛋白质且具有较高比活性的酶(例如 参照专利文献2)、在低温范围内的活性优异的酶(例如参照专利文献3、4)、和对氧化剂的稳定性得到改善的方法等(例如参照专利文献5)。 

但是，这些酶在非常高的碱性下的反应性、依赖于Ca²⁺离子的耐热性、在高浓度的表面活性剂或螯合剂中的稳定性等方面多数都存在各自的问题，至今发现的碱性蛋白酶存在无法充分发挥其功能的情况。 

专利文献1：特开平6-70765号公报 

专利文献2：特开平9-121855号公报 

专利文献3：特开平5-211868号公报 

专利文献4：特开平9-121856号公报 

专利文献5：欧洲专利第0130756号公报 

非专利文献1：Siezen等，ProteinEng.，4，719-737，1991 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型碱性蛋白酶以及编码该新型碱性蛋白酶的氨基酸序列的基因，所述新型碱性蛋白酶尽管在氨基酸序列上与上述那样的现有的枯草杆菌蛋白酶的相同性较低，但也在碱性耐性、表面活性剂耐性、耐热性等方面具有更优异的性质，并具有例如下述性质：其活性表达、热稳定性不受Ca⁺⁺离子的影响，对表面活性剂的稳定性优异，即使在高碱性条件下也能发挥充分的作用。 

本发明人为了解决上述问题，一直在自然界中寻求并查找这种在高碱性区域下也能充分发挥作用的蛋白酶。结果本发明人在南非德兰士瓦州的金矿地下的地下水及循环水洼的底泥中分离到的德兰士瓦嗜碱菌(Alkaliphillus transvaalensis)所产生的酶中，发现了对表面活性剂的稳定性优异且具有在高碱性条件下也能充分发挥作用的性质的新型碱性蛋白酶，并且获得了编码该微生物所产生的碱性蛋白酶的基因，从而完成了本发明。 

即，本发明提供一种具有如下理化性质的新型碱性蛋白酶。 

(1)作用： 

作用于酸化型胰岛素B链，在该酸化型胰岛素B链的29处肽键中， 切断至少为20处的肽键，切断最多为26处的肽键。 

(2)基质特异性：