[发明专利]高水平表达蛋白质的宿主细胞的选择

权利要求书

1.一种包含双顺反子转录单位的DNA分子，其编码：i)能在真核宿主细胞中选择的可选择标记多肽，及编码ii)感兴趣的多肽，所述感兴趣的多肽具有与可选择标记多肽分离的翻译起始序列，特征在于：

(i)感兴趣的多肽的编码序列在所述双顺反子转录单位中位于可选择标记编码序列的下游，

(ii)编码可选择标记多肽的序列在从可选择标记多肽的起始密码子之后直至感兴趣的多肽的起始密码子的编码链中无ATG序列，

(iii)编码可选择标记多肽的编码链中的翻译起始序列，所述翻译起始序列包含选自以下序列组成的组中的起始密码子：

a)在翻译起始的非最佳前后序列中的ATG起始密码子，包含序列(C/T)(A/T/G)(A/T/G)ATG(A/T/C)，后接间隔序列，其中所述间隔序列不含有二级结构，其中所述起始密码子加下划线；

b)GTG起始密码子；和

c)TTG起始密码子。

2.权利要求1的DNA分子，其中当任何ATG序列符合读框地存在并在编码野生型可选择标记多肽的序列中编码甲硫氨酸时，其被突变为编码缬氨酸、苏氨酸或者亮氨酸。

3.权利要求1或2的DNA分子，其中可选择标记多肽提供抗选择剂的致死或者生长抑制作用的抗性。

4.权利要求3的DNA分子，其中所述选择剂是抗生素。

5.权利要求3或4的DNA分子，其中所述选择剂选自如下一组：zeocin、嘌呤霉素、杀稻瘟素、潮霉素、新霉素、氨甲喋呤、甲硫氨酸腈肟磷及卡那霉素。

6.权利要求5的DNA分子，其中所述选择剂是zeocin。 

7.权利要求5的DNA分子，其中所述选择剂是杀稻瘟素。

8.权利要求5的DNA分子，其中所述选择剂是嘌呤霉素。

9.权利要求4的DNA分子，其中所述可选择标记多肽是由新霉素抗性基因编码的。

10.权利要求5的DNA分子，其中所述可选择标记多肽是由dhfr基因编码的。

11.前述任一项权利要求的DNA分子，其中所述可选择标记多肽是zeocin抗性多肽，其中在第9位的脯氨酸被改变为苏氨酸或苯丙氨酸。

12.一种包含前述任一项权利要求的DNA分子的表达盒，所述表达盒进一步包含一个位于所述双顺反子表达单位上游并且在真核宿主细胞中发挥起始所述双顺反子表达单位转录作用的启动子，所述表达盒进一步包含一个位于所述双顺反子表达单位下游的转录终止序列。

13.权利要求12的表达盒，其进一步包含至少一个染色质控制元件，选自如下一组：基质或骨架附着区、绝缘子序列、遍在染色质开放元件及抗阻抑物序列。

14.权利要求13的表达盒，其中所述染色质控制序列是抗阻抑物序列。

15.权利要求13的表达盒，其中所述染色体控制元件是选自如下一组的抗阻抑物序列：

a)SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.66任一序列；

b)a)的互补序列。

16.权利要求15的表达盒，其中所述表达盒包含SEQ.ID.NO.66，其中SEQ.ID.NO.66位于驱动双顺反子基因转录的启动子的上游。 

17.权利要求12-16任一项的表达盒，其中所述双顺反子基因两侧均有至少一个抗阻抑物序列。

18.权利要求17的表达盒，其包含：5’-抗阻抑物序列A-抗阻抑物序列B-启动子-编码功能性可选择标记蛋白质及其下游的感兴趣的多肽的多顺反子基因-转录终止序列-抗阻抑物序列C-3’，其中所述抗阻抑物序列A和C可以相同或不同，并且选自

a)SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.65任一序列，

其中所述抗阻抑物序列B是SEQ.ID.NO.66。

19.权利要求18的表达盒，其中抗阻抑物序列A和C是SEQ.ID.NO.7。

20.权利要求12-19任一项的表达盒，其中所述感兴趣的多肽是多聚体蛋白质的一部分。