[发明专利]转基因玉米种子中增强的玉米醇溶蛋白减少

说明书

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.119(e)要求于2004年2月10日提交的临时申请60/543,157号、2004年2月10日提交的临时申请60/543,187号和2004年8月11日提交的临时申请60/600,859号、2005年2月10日提交的实用新型申请11/057062号的优先权，所有申请的全部公开内容在此引入作为参考。

序列表的引入

文件“53428B.ST25.txt”包含了计算机可读形式的序列表，有21kb(在MS-window中测量)，于2005年2月9日创建，位于随同提交的CDROM上，并在此引入作为参考。

发明领域

本发明公开了氨基酸水平提升的转基因玉米种子、用于产生反义RNA基因抑制环的重组DNA构建体以及这种构建体和表达反义RNA基因抑制环的转基因植物的制备和使用方法。

背景

与其它植物相比，或与营养学上基于牛奶或鸡蛋设定的“完美”蛋白质模式相比，某些植物的特定氨基酸水平低。根据这些标准，玉米的赖氨酸、甲硫氨酸和色氨酸水平低。在转基因植物中提高氨基酸水平的努力包括表达重组DNA，与天然基因相比，该重组DNA能高水平地编码氨基酸合成途径中的蛋白质。一个用于在玉米中产生提升水平赖氨酸的此类基因是编码细菌二氢吡啶二羧酸合酶的基因。使氨基酸水平达到更高的策略包括抑制氨基酸分解代谢途径中蛋白质的编码基因。

基因抑制包括用于抑制基因的转录或与该基因相应的mRNA的积累来阻止转录物翻译为蛋白质的任一种熟知的方法。更详细地说，在美国专利5,107,065(Shewmaker等)和美国专利5,759,829(Shewmaker等)中公开了通过在植物细胞中插入带有反义方向DNA的重组DNA构建体来调节基因表达从而进行基因抑制。如Redenbaugh等在“Safety Assessment of Genetically Engineered FlavrSavr^TM Tomato，CRC Press，Inc.(1992)”中公开的，用这种用于基因抑制的反义方向DNA构建体转化的植物可包含整合型DNA，所述DNA是通过农杆菌介导转化而整合到植物中的、因若干拷贝转移DNA(T-DNA)的共同插入而排列成的反向重复。反向重复插入可构成T-DNA的一部分或全部，例如，T-DNA可含有完整或部分反义构建体的反向重复。当转化构建体是简单的反义DNA构建体时，对包含反向重复元件的插入DNA的筛选能够提高对基因沉默有效的转化事件的鉴定效率。

在美国专利5,283,184(Jorgensen等)和美国专利5,231,020(Jorgensen等)中公开了由带有有义方向DNA的插入重组DNA构建体产生的基因抑制。如Jorgensen等在MoL Gen.Genet，207：471-477(1987)中所公开的，在此类有义构建体通过农杆菌转化的植物中提供基因抑制的插入T-DNA，主要以反向重复结构构成。还可参见Stam等在The Plant Journal，12：63-82(1997)和De Buck等在Plant MoI.Biol.46 433-445(2001)的报道，他们利用分离法研究支持了Jorgensen的发现，即在许多事件中，基因沉默是由多聚的转基因T-DNA介导的，其中这些T-DNA以反向重复布置。当用简单的有义方向DNA构建体进行转化时，对包含反向重复元件的插入DNA的筛选能够提高基因沉默的效率。

用两套独立的转录单位同时从有义方向DNA和反义方向DNA进行RNA转录，也能有效地实施基因沉默，例如，Shewmaker等在美国专利5,107,065中公开的，在其实施例1中，制备了具备有义和反义aroA基因的双元载体。在国际公布说明书WO99/53050号(Waterhouse等)中公开了相似的构建体。还可参见美国专利6,326,193，其中将靶基因DNA与反向启动子操作性连接。