[发明专利]形成或分解聚氨基酸的地衣芽胞杆菌新基因产物以及据此改进的生物技术生产方法

说明书

本发明涉及了5种或4种来自地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的新基因及其基因产物，以及充分相似的基因和蛋白， 其能在体内参与聚氨基酸的形成、修饰和/或降解，并可用于该目的， 以及，据此改进的使用微生物的生物技术生产方法，该方法的特点为 这些基因的失活或激活。

本发明属于生物技术领域，具体来说是通过对能够形成所需适当 产物的微生物进行发酵，来制备该适当的产物。这包括了例如低分子 量化合物如膳食补剂或药用相关化合物的制备，或由于其多样性而具 有广泛的工业应用的蛋白的制备。在第一种情况下，利用或修改相关 微生物的代谢性质以制备适当的产物；在第二种情况下，使用能够表 达所需蛋白的基因的细胞。因此在两种情况下，大部分都涉及到遗传 修饰的生物(GMO)。

微生物发酵存在广泛的现有技术，特别是在工业规模上；它的范 围从通过发酵罐的技术设计对相关菌株的形成速度和营养利用进行最 适化，直到从相关细胞本身和/或发酵培养基中分离有价值的产物。遗 传的和微生物的、以及过程工程和生物化学方法都可应用于此。本发 明的目的是对该工艺中所用微生物的通常性质进行改良，这些性质损 害了实际的发酵步骤，特别是在所用菌株的遗传性质的水平上。

对于工业生物技术生产来说，相关的微生物培养在发酵罐中，所 述发酵罐的设计适合于它们的代谢性质。在培养过程中，它们对提供 的底物进行代谢，然后除了实际产物之外通常还形成大量的其它物质， 这些物质一般来说是不需要的，并且/或正如后文中将要解释的那样， 可能导致发酵或随后的过程中的困难。

一般来说，发酵是非常复杂的过程，其中有大量不同的参数必须 被调节或监测。因此，例如，常常涉及需氧过程，意味着在整个发酵 过程中必须给所用的微生物供应足够的氧气(控制通气速度)。其它 这样的参数的例子是反应器的几何形状、营养基的组成、pH或CO₂生 成速度的持续变化。对于经济学和过程管理本身而言都特别重要的参 数是必需的能量输入，例如通过搅拌系统确保反应器中的内容物尽可 能完全混合。此外，除了底物的分配之外，还需要保证生物体足够的 氧气供应。

在完成发酵之后，除了除去作为生产者的生物体之外，一般还必 需将所需的有价值的产物从所谓的发酵罐料浆中纯化和/或浓缩。随后 的工艺可以包括例如各种层析和/或过滤步骤。因此，除了有价值产物 的含量之外，对整个后续工艺的成功也具有决定性的是发酵罐料浆的 生物物理性质，特别是其在发酵完成后的即时粘度。

其性质也受所选微生物代谢活性的影响，也可能有不希望的效应 发生。这包括例如在发酵过程中营养培养基的粘度经常增加。这减弱 了混合，从而削弱了反应器内部的物质运输和氧气供应。其它的困难 大多数在随后的过程中发生，因为增加的粘度对于例如过滤过程的效 率具有相当大的损害。

已经知道具体来说，产生粘液的芽胞杆菌属菌种基本上由聚-γ-谷 氨酸(PGA)和/或-天冬氨酸组成，意味着聚氨基酸通过相关的γ肽键 链接。在对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的科学研究中，主要有3 种基因ywsC、ywtA和ywtB以及由它们衍生的基因产物与聚谷氨酸的 产生有关；ywtD基因的产物参与了降解。通用的基因标记符号“ywt” 与通常用于同样功能的缩写“cap”和“pgs”具有同样的意义。对此将在下 面解释。

M.Ashiuchi等的论文““Physiological and biochemical characteristics of poly gamma-glutamate synthetase complex of Bacillus subtilis”(2001)，Eur.J.Biochem.，vol268，p5321-5328，描述了来自枯草 芽孢杆菌的PgsBCA(聚-γ-谷氨酸合成酶复合物BCA)酶复合物，其 由3种亚基PgsB、PgsC和PgsA构成。根据该论文，该复合物是一种 非典型的酰胺连接酶，可以将谷氨酸的D和L对映体二者都转化为相 应的聚合物。根据该论文，其中描述的基因破坏实验将作为证据，表 明在枯草芽孢杆菌中，该复合物是唯一一个催化该反应的酶复合物。